姬松茸多糖提取物對高脂血癥大鼠降血脂作用研究

李 曉，盧學春，李雨鑫，劉馨竹，杜培革，安麗萍，*

(1.北華大學 藥學院，吉林省 吉林市 132013；2.中國人民解放軍總醫院 血液科，北京 100853)

姬松茸(AgaricusblazeiMurill,ABM)，又稱巴西蘑菇、小松菇、柏氏蘑菇，是一種食藥兼用的名貴真菌[1]，姬松茸多糖(Agaricusblazeipolysaccharide,ABP)是其主要活性成分之一。ABP具有抗氧化、降血脂、增強機體免疫力等[2-4]多種作用。

高脂血癥是一種常見和多發的脂代謝異常性疾病，可以引發脂肪肝、動脈粥樣硬化、冠心病等心腦血管疾病等，嚴重危害人類身體健康[5]。高脂血癥的發生是由于脂肪的代謝或者轉運異常，使血清中一種或者多種脂質高于正常范圍，主要是以總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)升高，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低為主要特征[6]。調節脂質代謝對預防和治療高脂血癥尤為重要。研究發現，天然產物中含有大量具有降血脂作用的物質，以天然產物中活性成分預防高脂血癥及相關疾病已成為現代生物研究領域的熱點[7]。大量研究表明，ABP具有降血脂活性，但是真菌多糖結構復雜，化學成分、結構和構象在很大程度上決定其生物活性。本研究團隊前期工作證明，ABP在體外具有抗氧化作用，可以減少油酸誘導的HepG2高脂細胞模型內脂滴堆積，降低細胞內TC和TG含量，說明ABP可能具有調節血脂的作用，但其具體降血脂成分和機制尚不明確。

本研究擬提取分離ABP，并對其進行DEAE-纖維素離子交換柱層析分級，得到進一步純化的姬松茸酸性多糖級分(ABP-A)，利用高脂飲食誘導高脂血癥大鼠模型，從生化指標、肝臟病理變化及肝臟代謝因子的表達水平，初步探討ABP-A降血脂的作用及機制。希望為進一步開發姬松茸相關功能食品和藥品提供實驗基礎和理論參考，促進姬松茸的深度開發。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物和材料

SPF級雄性Wistar大鼠，體重180～200 g，32只，實驗動物許可證編號為SCXK(吉)-2016-0003。姬松茸，江蘇省蘇威微生物研究有限公司，北華大學藥學院生藥教研室鑒定為姬松茸(AgaricusblazeiMurill,ABM)的干燥子實體；基礎飼料，長春億斯實驗動物技術有限責任公司；DEAE-纖維素、瓊脂糖凝膠CL-6B，美國Sigma-Aldrich公司；葡萄糖標準品，北京索萊寶科技有限公司；TC、TG、HDL-C、LDL-C ELISA試劑盒，武漢愛博泰克生物科技有限公司；低密度脂蛋白(LDL-R)、固醇調節原件結合蛋白(SREBP-1C)、膽固醇7a-羥化酶(CYP7a-1)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)、B類清道夫F(SCARB-1F)、GAPGH引物，北京鼎盛昌盛生物技術有限公司；RNA提取試劑盒、One Step RT-PCR Kit試劑盒，諾唯贊生物科技有限公司。其他試劑均為分析純。

1.1.2儀器與設備

BenchTop Pro型臺式冷凍干燥機，美國Virtis公司；UV-2550型紫外可見分光光度計、LC-16型高效液相色譜儀，島津國際貿易有限公司；Infinite M200型酶標儀，瑞士TECAN公司；A200型PCR儀，杭州朗基科學儀器有限公司；Champchemi Basic型全自動熒光及化學發光凝膠成像儀，北京賽智創業科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1姬松茸多糖的提取及含量測定

將姬松茸子實體常溫粉碎，過60目篩，按料液比1∶20(g∶mL)加入蒸餾水浸泡過夜，100 ℃浸提3 h，重復3次，過濾并合并濾液，于 60 ℃真空減壓濃縮；加入4倍體積的無水乙醇沉淀過夜，沉淀物用乙醇洗后烘干，得到姬松茸粗多糖；蒸餾水溶解粗多糖后，用截留分子質量為3 500 Da的透析袋，于蒸餾水中透析48 h以除去小分子物質，-80 ℃冷凍干燥，得到精制后的ABP。分別采用苯酚- 硫酸法[8]、間羥基聯苯法[9]、考馬斯亮藍法[10]分析ABP中糖、糖醛酸和蛋白質的含量，測定樣品中灰分含量[11]。單糖成分分析采用HPLC系統(LC-10ATVP泵和SPD-10AVD紫外光檢測器)，Inertsil ODS-35色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相為磷酸緩沖鹽溶液(PBS 0.1 mol/L，pH值7.0)-乙腈(二者體積比為82∶18)，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL，檢測波長為245 nm[12-13]。

1.2.2姬松茸多糖的分離純化

稱取8 g ABP樣品，配制成質量濃度為8 mg/mL的溶液，磁力攪拌過夜，使其充分溶解。將樣品溶液以4 000 r/min離心15 min，取上清液，利用平衡好的DEAE-纖維素柱(7.5 cm×30 cm，Cl-型)進行分級，用0.5 mol/L NaCl溶液洗脫。利用截留分子質量為3 000 Da的中空纖維柱除去洗脫液鹽離子，于60 ℃真空減壓濃縮，-80 ℃冷凍干燥。

1.2.3實驗動物模型的建立及給藥

雄性Wistar大鼠32只，適應性喂養7 d，溫度20.0～22.0 ℃，相對濕度50%～60%。將大鼠隨機分成4組，即空白對照組(NG)、模型組(MG)、辛伐他汀陽性對照組(PG)、姬松茸多糖組(ABP-A)，每組8只。NG組飼喂基礎飼料100(g/kg)·d-1，MG、PG、ABP-A組飼喂高脂飼料100(g/kg)·d-1，自由飲水。建立模型的同時灌胃給藥，PG組給予4.8(mg/kg)·d-1辛伐他汀水溶液，ABP-A組給予640(mg/kg)·d-1ABP-A提取物水溶液，NG與MG組給予等體積蒸餾水，連續42 d。

1.2.4大鼠體質量、臟器指數的測定

每周固定時間記錄各組大鼠體質量及其變化情況。末次給藥后，當晚禁食不禁水，于次日上午，腹腔注射5%水合氯醛(0.75 mL/100 g)，待大鼠麻醉后準確稱量麻醉完全的大鼠體質量和大鼠肝臟濕質量并詳細記錄，計算肝臟質量與體質量的比值。見式(1)。

臟器指數=臟器濕質量/體質量×100% 。

(1)

式(1)中，臟器濕質量，mg；體質量，g。

1.2.5血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量的測定

大鼠麻醉后腹主動脈取血，3 000 r/min離心10 min分離血清。參照酶聯免疫試劑盒說明書的方法測定大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。

1.2.6肝臟組織HE染色

大鼠肝臟浸于10%福爾馬林中固定1周，蘇木精- 伊紅染色法(hematoxylineosin staining,HE)染色[14]。

1.2.7肝臟組織中LDL-R、SREBP-1C、CYP7a-1、PPAR-α、SCARB-1F的mRNA表達水平檢測

取15 mg肝臟提取總RNA并定量，每組各取2 μg逆轉錄得到cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。按照試劑盒說明書進行RT-PCR擴增，反應條件為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環30次后72 ℃延伸5 min。擴增完成后進行瓊脂糖凝膠電泳，電壓80 V，時間45 min。

電泳完成后利用凝膠成像儀采集圖像，Image J計算熒光強度值，以GAPGH為內參進行標準對照。表1為LDL-R、SREBP-1C、CYP7a-1、PPAR-α、SCARB-1F的引物序列。

表1 LDL-R、SREBP-1C、CYP7a-1、PPAR-α、SCARB-1F的引物序列Tab.1 Primer sequence of LDL-R，SREBP-1C，CYP7a-1， PPAR-α，SCARB-1F

1.3數據處理

2 結果與分析

2.1 姬松茸多糖的成分及含量分析

表2為ABP的成分分析結果。由表2可見：ABP中總糖質量分數為751 mg/g，糖醛酸質量分數為19 mg/g，蛋白質質量分數為56 mg/g。圖1為ABP的單糖組成的HPLC分析結果，對圖1中各峰面積進行計算，得表3(ABP的單糖含量分析結果)。由表3可見：ABP的單糖組成及質量分數分別為葡萄糖(Glc)(600 mg/g)、半乳糖(Gal)(284 mg/g)、甘露糖(Man)(62 mg/g)、鼠李糖(Rha)(4 mg/g)、半乳糖醛酸(GalA)(1 mg/g)、木糖(Xyl)(12 mg/g)、阿拉伯糖(Ara)(1 mg/g)、巖藻糖(Fuc)(36 mg/g)。

圖1 ABP的單糖組成HPLC分析結果Fig.1 Results of monosaccharide composition of ABP by HPLC

表2 ABP的成分分析結果Tab.2 Results of component analysis of ABP mg/g

表3 ABP的單糖質量分數Tab.3 Monosaccharide content of ABP mg/g

2.2 姬松茸多糖的分離純化結果分析

利用DEAE-纖維素柱對ABP進行離子交換層析分級。用0.5 mol/L NaCl 溶液洗脫得到酸性糖級分ABP-A，以試管編號為橫坐標，以490 nm處吸光度值為縱坐標，得到如圖2所示的洗脫曲線。表4為ABP-A的成分分析結果，由表4可見：ABP-A 的得率為47.5%，ABP-A中總糖質量分數為741 mg/g，糖醛酸質量分數為182 mg/g，蛋白質質量分數為48 mg/g。圖3為ABP-A的單糖組成HPLC分析結果，對圖3中各峰面積進行計算，得表5(ABP-A的單糖含量)。由表5可見：ABP-A的單糖組成及質量分數分別為Glc(886 mg/g)、Gal(24 mg/g)、Man(19 mg/g)、Rha(10 mg/g)、GalA(5 mg/g)、Xyl(19 mg/g)、Ara(21 mg/g)、Fuc(16 mg/g)。

圖2 ABP經 DEAE-纖維素柱后的洗脫曲線Fig.2 Elution curve of ABP after DEAE-cellulose column

表4 ABP-A的成分分析結果Tab.4 Results of component analysis of ABP-A mg/g

圖3 ABP-A的單糖組成HPLC分析結果Fig.3 Results of monosaccharide composition of ABP-A by HPLC

表5 ABP-A的單糖質量分數Tab.5 Monosaccharide content of ABP-A mg/g

2.3 ABP-A對高脂血癥大鼠一般狀態及體質量的影響

圖4為ABP-A與大鼠體質量變化關系的分析結果，由圖4可見：NG組大鼠體質量持續增長，與NG組相比，MG組大鼠造模第4周后體質量顯著增長(P<0.05)；與MG組相比，PG組大鼠和ABP-A組大鼠分別從造模后第4周和第5周后體質量顯著降低(P<0.05)，增長趨勢緩慢。

圖5為大鼠相對肝臟指數隨ABP-A干預的變化情況，由圖5可見：與NG組相比，MG組大鼠的相對肝臟指數極顯著升高(P<0.01)；與MG相比，ABP-A組相對肝臟指數顯著降低(P<0.05)。

2.4 ABP-A對高脂血癥大鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的影響

圖6為大鼠血清生化指標測定結果，由圖6可見：與NG組相比，MG組大鼠血清TC、TG、LDL-C含量極顯著上升(P<0.01)，HDL-C含量極顯著下降(P<0.01)；與MG組相比，ABP-A組大鼠血清TC、TG、LDL-C含量極顯著降低(P<0.01)，HDL-C含量極顯著升高(P<0.01)。

*表示與NG組相比差異顯著 (P<0.05)，#表示與MG組相比差異顯著(P<0.05)，▲表示差異極顯著(P<0.01)。圖4 ABP-A對大鼠體質量的影響Fig.4 Effect of ABP-A on body weight of rats

*表示與NG組相比差異顯著 (P<0.05)，** 表示差異極顯著 (P<0.01)；#表示與MG組相比差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)。圖5 ABP-A對高脂血癥大鼠相對肝臟指數的影響Fig.5 Effect of ABP-A on relative liver index in hyperlipidemia rats

*表示與NG組相比差異顯著(P<0.05)，** 表示差異極顯著(P<0.01)；#表示與MG組相比差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)。圖6 ABP-A對高脂血癥大鼠血清生化指標的影響Fig.6 Effect of ABP-A on serum biochemical parameters in hyperlipidemia rats

2.5 ABP-A對高脂血癥大鼠肝臟組織的影響

圖7為大鼠肝細胞HE染色結果，由圖7可見：NG組[圖7(a)]肝組織排列整齊，細胞核清晰可見，肝組織結構較完整；MG組[圖7(b)]肝細胞體積變大，可見廣泛的肝細胞脂肪變性，有大量脂滴沉積；PG組[圖7(c)]，肝細胞排列緊致，形態恢復正常，細胞內脂滴消失；ABP-A組[圖7(d)]肝細胞排列及結構整齊，未見細胞內存在脂滴。

2.6 ABP-A對高脂血癥大鼠肝臟中mRNA表達量的影響

放大倍數：40倍。圖7 大鼠肝臟組織病理學變化Fig.7 Histopathological changes in rat liver

圖8為大鼠肝臟組織中mRNA表達量分析結果。圖8(a)為RT-PCR法檢測大鼠肝臟中mRNA表達結果，使用Image J對圖8(a)進行灰度分析，得出圖8(b)至圖8(f)。由圖8可見：與NG組相比，MG組的SCARB-1F mRNA 的相對表達量顯著降低(P<0.05)，LDL-R、CYP7a-1、PPAR-α mRNA的相對表達量極顯著降低(P<0.01)，SREBP-1C mRNA的相對表達量極顯著升高(P<0.01)；與MG組相比，ABP-A組的LDL-R、SCARB-1F mRNA的相對表達量顯著升高(P<0.05)，CYP7a-1、PPAR-α mRNA的相對表達量極顯著升高(P<0.01)，SREBP-1C mRNA的相對表達量極顯著降低(P<0.01)。

3 結 論

肝臟是機體內參與脂質代謝的重要器官，研究發現，長期飼喂高脂飲食會引起肝臟組織腫大[15-16]。本實驗利用高脂飲食誘導建立高脂血癥大鼠模型，MG組大鼠的肝臟指數，血清TC、TG、LDL-C顯著升高，說明高脂大鼠模型建立成功。ABP-A干預后大鼠血清TC、TG、LDL-C顯著降低，HDL-C顯著升高，肝臟細胞內脂滴沉積減少，提示ABP-A具有降低高脂血癥大鼠血脂作用。

機體內脂質代謝的過程極其復雜，受多種因素共同調節，維持機體脂類代謝的穩態依賴于脂質的合成、吸收及排泄這3條主要代謝途徑[17]。PPAR-α高表達于肝臟，能與脂肪酸及其衍生物結合并活化，減少肝臟中脂質積累，從而啟動一系列與脂質代謝有關的酶的轉錄，對維持脂質代謝的平衡起著十分重要的調節作用[18-19]。PPAR-α能通過誘導肝X受體的表達引起CYP7a-1表達的上調[20]。CYP7a-1是肝臟TC代謝為膽汁酸的第一步限速酶，催化TC分解為膽汁酸，主要分布于肝臟，在維持脂質代謝的內環境穩態中起著重要作用[21-22]。TC在機體內能夠被徹底氧化分解，主要是通過細胞膜表面的LDL-R對外源性膽固醇的內吞作用，將其吸收入細胞內，并轉化為類固醇激素等，起到維持人體生理功能的作用[23-24]。CYP7a-1基因的表達上調可以增加LDL-R的表達，進而影響TC和脂蛋白的代謝，加速TC轉化為膽汁酸的代謝過程[25]。本實驗結果提示，ABP-A干預后高脂大鼠肝臟中LDL-R、CYP7a-1、PPAR-α因子表達上調。SREBP-1C的靶基因是控制脂肪酸合成的限速酶，脂肪酸及其部分代謝產物是具有肝細胞毒性的分子，作用于肝細胞可引起線粒體腫脹和通透性增加，肝細胞變性、壞死和炎細胞浸潤而誘發脂肪性肝炎[26]。SCARB-1F是清道夫受體蛋白的B類家族的成員，是一種具有特殊功能的膜蛋白，主要在肝臟中表達，在介導選擇性脂質攝取并且在逆向轉運TC中起關鍵作用[27-28]，能夠直接與多種蛋白質和脂質發生作用。SREBP-1C過度表達可以引起SCARB-1F表達的下調。實驗結果表明，ABP-A干預后能下調高脂血癥大鼠肝臟中SREBP-1C的表達，同時上調SCARB-1F的表達，因此，提示ABP-A可以減少脂質在肝臟中積累，調節脂質代謝紊亂，有明顯的降脂作用。

*表示與NG組相比差異顯著 (P<0.05)，**表示差異極顯著 (P<0.01)；#表示與MG組相比差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)。圖8 ABP-A對高脂血癥大鼠肝臟組織中mRNA表達量的影響Fig.8 Effect of ABP-A on mRNA expression in liver tissue of rats with hyperlipidemia

本研究證實ABP-A對高脂飲食誘導的高脂血癥大鼠有顯著的降血脂作用，作用機制與其對肝臟脂質代謝關鍵因子LDL-R、SREBP-1C、CYP7a-1、PPAR-α、SCARB-1F的調控有關。希望本研究可為進一步開展姬松茸降血脂功能食品和藥品的研發提供理論參考。