不同熱處理脫脂乳粉對褐色乳酸菌飲料穩定性的影響

余志堅，張 敏，姚夢柯，趙 娟，陳 超，曹永強，楊貞耐,，*

(1.北京工商大學 北京食品營養與人類健康高精尖創新中心/北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048；2.贛州市畜牧研究所，江西 贛州 341000；3.東君乳業(禹城)有限公司，山東 德州 253000)

褐色乳酸菌飲料是指以脫脂乳粉和葡萄糖為原料，經高溫長時間美拉德反應褐變，冷卻后接種乳酸菌，再發酵得到發酵乳，并以此為基料，加入水、甜味劑、酸味劑、穩定劑、香精調配而成的發酵型乳酸菌飲料[1]。在高溫褐變階段，美拉德反應賦予產品良好的風味和口感；在長時間發酵階段，乳糖降解為乳酸，蛋白質降解為小肽段和氨基酸，有利于人體吸收。目前，褐色乳酸菌飲料根據其生產過程中發酵處理后是否經過殺菌可分為活菌型和殺菌型?；罹彤a品需冷鏈運輸保藏；而殺菌型產品中不存在活菌，可常溫保存6個月以上，但是產品易出現分層、沉淀等不穩定現象[2]。脫脂乳粉是以新鮮牛乳為原料,離心脫脂后經殺菌、蒸發濃縮，噴霧干燥制成，其中蛋白質不低于非脂乳固體的34%，脂肪不高于2.0%[3]。脫脂乳粉根據其生產過程中脫脂乳熱處理殺菌溫度不同，通?？煞譃楦邷?80 ℃，30 min或120 ℃，1 min )、中溫(75 ℃，1～3 min)和低溫脫脂乳粉(75 ℃，15 s)。由于脫脂乳粉不同熱處理生產時受熱程度不同，乳酸菌飲料產品穩定性也不同。合適的熱處理脫脂乳粉作為褐色乳酸菌飲料的原料，對產品穩定性具有重要影響。

本研究擬通過比較不同熱處理(高溫、中溫、低溫)脫脂乳粉的理化性質，包括溶解性、乳化性和乳化穩定性、起泡性和起泡穩定性、乳清蛋白氮指數及粒徑的差異；并以鮮制脫脂乳作為對照，進一步比較以不同熱處理脫脂乳粉為原料的殺菌型褐色乳酸菌飲料在生產過程中的粒徑、電位、離心沉淀率及Lumisizer穩定性等。本研究通過確定生產褐色乳酸菌飲料的最佳熱處理脫脂乳粉及影響飲料穩定性的關鍵工藝，以期為改進褐色乳酸菌飲料加工工藝并提高其儲藏穩定性提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛乳，北京半截河奶牛場；低溫脫脂乳粉，內蒙古蘭多河乳品有限公司；中溫脫脂乳粉，新西蘭恒天然乳品有限公司；高溫脫脂乳粉，北京萬寶乳業有限公司；色拉油，金龍魚食品有限公司；葡萄糖，山東西王糖業有限公司；白砂糖，太古糖業(中國)有限公司；干酪乳桿菌N115，北京工商大學乳品實驗室保藏菌種；果膠，河南萬邦實業有限公司；硫酸銅、硫酸鉀、鹽酸、硼酸、氫氧化鈉、甲基紅、亞甲基藍、無水乙醇、異戊醇(均為分析純)，上海麥克林生化科技有限公司；酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、十二烷基硫酸鈉、氯化鈉(均為分析純)、質量分數98%濃硫酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

CP124S型分析天平，德國Startorius公司；CR21GⅢ型臺式離心機、U-3900型紫外可見分光光度計，日本Hitachi公司；Kjeltec8100型全自動凱氏定氮儀，福斯分析儀器有限公司；R30型攪拌器，上海弗魯克流體機械有限公司；HZQ-Q型振蕩器，東聯電子技術有限公司；HSW12型恒溫水浴鍋、THZ-D型電熱恒溫培養箱、DHG-9055A型鼓風干燥箱，上海一恒實驗設備有限公司；D-3L型高壓均質機，美國phd-tech公司；Nano 900型粒徑電位儀，馬爾文儀器有限公司；MLS-3750型高壓蒸汽滅菌器，日本三洋公司；Lumisizer穩定性分析儀，德國LUM公司；BCN-1360B型超凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造公司。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品液的制備

不同脫脂乳粉按每100 mL去離子水中溶解12 g脫脂乳粉還原；新鮮牛乳在室溫(25 ℃)下8 000 r/min脫脂，過濾后備用，4 ℃冷藏備用，使用前室溫下平衡1 h。

1.3.2脫脂乳主要成分及乳酸度測定

參照GB 5009.3—2016，使用直接干燥法測定水分含量。參照GB 5009.5—2016，使用凱氏定氮法測定蛋白質含量。參照GB 5009.6—2016，使用蓋勃法測定脂肪含量。參照GB 5009.239—2016，使用酚酞指示劑法測定復原乳乳酸度。

1.3.3脫脂乳乳化性及乳化穩定性的測定

取樣品液30 mL，緩慢加入色拉油10 mL，邊加邊攪拌，使其充分混合，12 000 r/min剪切1 min，充分乳化后得到乳狀液，吸取底部50 μL乳狀液，迅速和5 mL質量濃度為0.1 g/mL的SDS混合均勻，于500 nm處測其吸光度，10 min后再測其吸光度。乳化性和乳化穩定性計算見式(1)、式(2)。

(1)

(2)

式(1)、式(2)中，EAI，乳化活力指數，指每克蛋白的乳化面積，m2/g；A500 nm，樣品在500 nm下的吸光度；ρ，樣品蛋白質量濃度，g/mL；L，比色杯直徑，cm；N，稀釋倍數；φ，油相所占體積分數，%；ES，乳化穩定性，%；A0，0 min吸光度；A10，10 min時吸光度。

1.3.4脫脂乳起泡性及起泡穩定性的測定

取100 mL樣品液，10 000 r/min剪切1 min后，倒入250 mL的量筒中，泡沫體積即為起泡性(mL)，30 min后，殘留泡沫體積為起泡穩定性(mL)。

1.3.5脫脂乳粉乳清蛋白氮指數的測定

稱取10 g脂肪乳粉復原于100 mL去離子水中。加入8.0 g NaCl沉淀酪蛋白及變性乳清蛋白，加塞后35～40 ℃水浴30 min，前15 min不停搖動，使蛋白質充分析出，靜置15 min，趁熱過濾后，凱氏定氮法測定濾液中的未變性的乳清蛋白質氮含量(mg/g)，即WPN值。對WPN值進行修正得到乳清蛋白氮指數(WPNI)，計算見式(3)。

(3)

式(3)中，WPNI，乳清蛋白氮指數；w，樣品的水分含量，%；WPN，凱氏定氮測定的樣品未變性乳清蛋白氮含量。

1.3.6脫脂乳粉的粒徑測定

用Nano 900型激光粒徑分析儀測定脫脂乳粉粒徑。測試參數：水的折光指數為1.33，蛋白質的折光指數為1.529，吸光度為0，測試溫度為25 ℃恒溫。樣品用超純水稀釋100倍后，過膜使用。

1.3.7殺菌型褐色乳酸菌飲料生產工藝

殺菌型褐色乳酸菌飲料的生產工藝參考王光強等[4]的方法并有所改進(見圖1)。葡萄糖90 ℃熱水溶解，冷卻至35 ℃備用；脫脂乳粉45 ℃水溶解，剪切乳化15 min，并與葡萄糖水混合后定容，靜置水合30 min。以鮮乳制備的脫脂乳為原料時，將牛乳8 000 r/min，20 min離心2次，過濾除去脂肪后，與葡萄糖水混合后定容靜置水合。將混合物進行均質處理(65 ℃，15 MPa)，然后殺菌(65 ℃，30 min)。95 ℃高溫褐變至標準顏色，充分冷卻至39 ℃，接種干酪乳桿菌N1115(109CFU/mL)，混合均勻后，于37 ℃恒溫培養箱中培養72 h后剪切破乳，20 MPa冷均質后備用。添加葡萄糖、白砂糖、果膠等輔料，與發酵液混合，剪切后調酸定容。將料液熱均質(65 ℃，25 MPa)，然后灌裝。將灌裝后的飲料85 ℃殺菌30 min，冷卻后進庫保藏。

圖1 褐色乳酸菌飲料生產工藝Fig.1 Production process of brown Lactobacillus beverage

1.3.8殺菌型褐色乳酸菌飲料穩定性評價

斯托克斯定律[式(4)]描述了顆粒的沉降速度與顆粒和流體的半徑及黏度的關系。

(4)

式(4)中，v，顆粒沉降速度，m/s；r，顆粒半徑，m；ρs，顆粒密度，kg/m3；ρf，流體密度，kg/m3；g，重力加速度，取9.81 m/s2；η，流體黏度，Pa·s。

根據斯托克斯定律，影響顆粒沉降速度的因素是顆粒粒徑、顆粒與流體的密度差、流體黏度。褐色乳酸菌飲料中顆粒的沉降接近于球形顆粒在層流區域的自由沉降過程，因此可以依據斯托克斯定律判定飲料的沉降過程，來評判飲料的穩定性。

1) 粒徑測定：采用Nano 900型粒徑電位分析儀測定粒徑的分布情況。動態光散射原理表明，粒子顆粒越小，布朗運動越快，光強變化越快。測試的參數為水的折光指數1.33，蛋白質的折光指數1.529，吸光度0，測試溫度25 ℃恒溫。樣品用超純水稀釋100倍后，過膜使用。

2) zeta電位測定：用Nano 900型激光粒徑分析儀測定飲料體系中zeta電位。在外加電場時，帶電粒子向著電荷相反的方向運動，運動速度與zeta電位直接相關。測試的參數為水的折光指數1.33，蛋白質的折光指數1.529，吸光度0，測試溫度25 ℃恒溫。樣品用超純水稀釋100倍后，過膜使用。

3) 離心沉淀率測定：在離心管中加入10 mL左右的乳飲料，進行離心，離心條件為4 000 r/min，10 min，4 ℃，取出后棄去上層溶液，倒置靜置10 min后，準確稱取沉淀質量(g)。離心沉淀率(%)的計算見式(5)。

離心沉淀率=[m(離心后)-m(離心管)]/
[m(離心前)-m(離心管)]×100% 。

(5)

4) Lumisizer穩定性測定：將平衡后的樣品加入Lumisizer專用樣品池中，進行檢測。檢測條件為曲線個數255，4 000 r/min，時間間隔為30 s。檢測完畢使用Lumisizer專用軟件進行數據分析。

1.4 數據處理

所有實驗均重復3次，結果表示為3次平行實驗的平均值±標準差。采用Microsoft Excel 2016、Origin 2018等軟件進行數據分析并繪圖，IMB SPSS Statistics 25.0對數據進行顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同熱處理脫脂乳粉的理化性質比較

2.1.1脫脂乳粉復原乳的主要成分及乳酸度分析

表1比較了不同熱處理脫脂乳粉復原乳以及鮮制脫脂乳的水分、蛋白質、脂肪含量及乳酸度的測定結果。除鮮制脫脂乳的脂肪含量高于復原乳外，各樣品的其他指標差異不顯著，且均符合國家標準。蛋白質中含氮量約為總蛋白質含量的16%，測定出含氮量后換算得到蛋白質的含量，蛋白質熱變性是對高級結構的破壞，并不改變其一級結構和含氮量，因此熱處理并未對蛋白質含量造成顯著影響。不同預熱溫度處理對脫脂乳粉產品的主要成分含量和乳酸度均無顯著影響。

表1 不同熱處理脫脂乳粉復原乳及鮮制脫脂乳的主要成分及乳酸度Tab.1 Main components and acidity of reconstituted milk prepared from skim milk powder with different heat treatments and freshly skim milk

2.1.2脫脂乳粉的溶解度分析

溶解度是指乳粉在水中溶解并形成均一溶液的能力。圖2顯示低溫、中溫、高溫脫脂乳粉的溶解度分別為99.4、99.3、99.1 g/100 g，溶解度均較好且差異不顯著(P>0.05)。

2.1.3脫脂乳粉復原乳的乳化性及乳化穩定性分析

*表示數據間差異不顯著(P>0.05)。圖2 不同熱處理脫脂乳粉的溶解度Fig.2 Solubility of reconstituted milk prepared from skim milk powder with different heat treatments

蛋白質作為一種兩親物質，可以降低界面張力，將油相和水相結合形成乳狀液。蛋白質吸附在乳化微粒表面形成乳化吸附層，使微粒帶上電荷，形成電荷排斥作用[5]；另一方面，微粒之間互相接近時，乳化劑吸附層之間產生排斥力，防止油滴碰撞凝聚，維持乳化體系穩定[6]。蛋白質的乳化性與乳化穩定性隨著熱處理強度的增大而顯著降低(P<0.05)，這可能與乳蛋白質受熱變性有關，見圖3。受熱時天然蛋白高級結構解體，蛋白質開始凝聚，減少可以乳化和穩定乳化液的天然蛋白含量，降低了乳化吸附層蛋白質膜的黏度和硬度[7]；同時暴露出更多的內部疏水基團，蛋白質的親水親油平衡破壞，從而降低蛋白質的乳化性及乳化穩定性[8]。

2.1.4脫脂乳粉復原乳的起泡性及起泡穩定性分析

*與**表示數據間差異顯著(P<0.05)；*、#表示數據間差異不顯著(P>0.05)。圖3 不同熱處理脫脂乳粉復原乳及鮮制脫脂乳的乳化性及乳化穩定性Fig.3 Emulsification and emulsibility of reconstituted milk prepared from skim milk powder with different heat treatments and freshly skim milk

蛋白質能夠在氣- 液界面形成堅韌的薄膜使大量氣體進入，并維持所形成氣泡不破裂。隨著原料受熱程度的增大，起泡性與起泡穩定性均顯著降低(P<0.05)，見圖4。影響蛋白質起泡的因素有蛋白質分子擴散速率、界面張力大小和疏水基團的分布[9]。泡沫蛋白膜的機械強度取決于分布在界面上的蛋白質之間的各種作用力，包括經典相互作用、氫鍵、疏水相互作用以及分子間二硫鍵的聚合作用，當各種力達到平衡時，界面的蛋白膜會穩定而富有彈性[10]。受熱時蛋白質的高級結構解體內部疏水基團暴露[11]，增加了蛋白質的疏水性使其發生聚集，降低蛋白質分子擴散成膜速率；同時二硫鍵發生不可逆變化，形成了包含高比例的所有乳清蛋白、κ-酪蛋白(к-CN)和一部分αs2-酪蛋白(αs2-CN)的二硫鍵結合聚集體[12]，導致蛋白膜表面作用力平衡被破壞，樣品起泡性和起泡穩定性下降。Dissanayake等[13]將乳清蛋白噴霧干燥后，探究其溶解度、熱穩定性、乳化和起泡性能，結果表明熱處理使乳清蛋白熱凝固時間延長，起泡性降低，這與本研究結果一致。

2.1.5脫脂乳粉的蛋白質變性程度分析

*、**、***表示數據間差異顯著(P<0.05)；#、##、###表示數據間差異顯著(P<0.05)。圖4 不同熱處理脫脂乳粉復原乳及鮮制脫脂乳的起泡性及起泡穩定性Fig.4 Foaming property and foamability of reconstituted milk prepared from skim milk powder with different heat treatments and freshly skim milk

原料乳中的乳清蛋白熱敏性高，而酪蛋白對熱較穩定，通過除去酪蛋白和部分變性乳清蛋白，剩余的蛋白含量可以用來表示原料乳的受熱變性情況。WPNI是指每克脫脂乳粉中未變性乳清蛋白氮的毫克數。WPNI值越高，蛋白變性程度越低[14]，見圖5。

*、**、***表示數據間差異顯著(P<0.05)。圖5 不同熱處理脫脂乳粉的乳清蛋白氮指數Fig.5 WPNI values of skim milk powder samples with different heat treatments

從圖5可以看出，原料受熱程度增加,乳清蛋白的變性程度顯著增加(P<0.05)。熱處理乳粉中未變性的乳清蛋白主要是α-La、β-Lg和BSA。熱處理會破壞乳清蛋白的二級結構，使蛋白質分子伸展變性[15]。在低于100 ℃的條件下加熱脫脂乳，若加熱時間過長，同樣可破壞大部分的乳清蛋白，造成乳清蛋白損失，一定程度上降低牛乳風味[16]。

進一步測定不同脫脂乳粉復原乳樣品的粒徑，見圖6。由圖6可知，中、高溫脫脂乳粉復原乳的粒徑顯著大于鮮制脫脂乳和低溫脫脂乳粉復原乳的粒徑(P<0.05)。酪蛋白是由β-CN、αs1-CN、αs2-CN、κ-CN 4種單體組裝的復合物[17]。熱處理使蛋白質的高級結構受到破壞，β-CN、αs1-CN、αs2-CN從膠束上解離，膠束表面的κ-CN與β-Lg 以巰基-二硫鍵的方式進行交換，進而附著于膠束表面，聚合成絡合物，疏水作用增強會進一步促進κ-CN與β-Lg的結合，粒徑會逐步增大[18]。同時蛋白質電荷發生變化，蛋白質趨于聚集，也導致大分子物質的形成[19]。Corredig等[20]發現，隨著溫度不斷升高，酪蛋白顆粒表面粘附的小顆粒逐漸增多，顆粒直徑逐漸增大，這與本研究結果相似。

2.2 不同熱處理脫脂乳粉對殺菌型褐色乳酸菌飲料穩定性的影響

2.2.1飲料生產過程中的粒徑變化

*與**表示數據間差異顯著(P<0.05)；*表示數據間差異不顯著(P>0.05)。圖6 不同熱處理脫脂乳粉復原乳及鮮制脫脂乳的粒徑Fig.6 Particle sizes of reconstituted milk prepared from skim milk powder with different heat treatments and freshly skim milk

依據斯托克斯定律，顆粒半徑越大，顆粒的沉降速度就越快，體系越容易出現水析分層的沉淀，樣品穩定性越差[21]。各組樣品在飲料生產過程中粒徑變化趨勢一致，即在95 ℃高溫褐變及發酵后體系微粒粒徑顯著增大，均質處理使粒徑大幅下降，見圖7。美拉德反應可能給體系帶來更加復雜的化學組成，除了蛋白糖基化反應，還有其他非蛋白的聚合反應使蛋白質顆粒體積變大，產品穩定性下降[22-23]。使用中溫脫脂乳粉為原料的產品粒徑最小，可能是由于中溫乳粉蛋白質變性程度適中，高級結構適當展開，鏈節變得更加柔軟，暴露出適量的疏水基團，改善蛋白質的雙親性，使蛋白質分子有序排列，更易吸附于界面上。因此，物料的受熱程度、加工過程的均質處理和配料定容是影響飲料穩定性的重要因素。

圖7 不同熱處理脫脂乳粉對飲料生產過程中粒徑的影響Fig.7 Effects of skim milk powder with different heat treatments on particle size during process of beverage production

2.2.2飲料生產過程中的zeta電位變化

zeta電位絕對值反映膠體粒子表面帶電荷情況，zeta電位的絕對值越高，顆粒間電荷排斥作用增強，體系穩定性越好。在飲料的生產過程中，中溫乳粉為原料的產品電位絕對值最大，見圖8。表明適當的熱處理使乳清蛋白變性，蛋白質基團暴露，體系內電荷增多，有利于體系的穩定；但熱處理程度進一步加大時，蛋白質變性嚴重，體系失穩[24]。高溫褐變后體系電位絕對值明顯下降，加入果膠配料后體系電位絕對值顯著增加，表明高溫褐變及加入果膠配料是影響飲料穩定性的重要工藝。酸性條件下，果膠上的—COOH負電荷和酪蛋白上的—NH2負電荷之間具有穩定的靜電相互作用[25]，使酪蛋白微粒被帶負電荷的果膠分子包圍而帶上大量負電荷[26]。

圖8 不同熱處理脫脂乳粉對飲料生產過程中zeta電位的影響Fig.8 Effect of skimmed milk powder with different heat treatments on zeta potential during process of beverage production

2.2.3飲料生產過程中的離心沉淀率變化

酸性乳飲料中，蛋白質會出現不同程度的聚集或沉降作用，致使體系失穩而形成沉淀。通過測定離心沉淀率可以表征樣品中的粒子分布情況，進而反映樣品的穩定性[27]。飲料生產過程中的離心沉淀率變化見圖9。由圖9可知，高溫褐變顯著提高了離心沉淀率；發酵液經均質后，體系中游離的H+與酪蛋白表面負電荷發生中和，減弱了蛋白質膠體之間的靜電排斥作用，蛋白質開始聚集而沉淀[28]。因此，發酵均質后離心沉淀率仍然較高。配料后，由于水的稀釋作用及加入果膠產生的保護層，離心沉淀率顯著下降。中溫脫脂乳粉為原料的產品離心沉淀率低于其他3組，表明以中溫脫脂乳粉生產的飲料穩定性最佳；而使用鮮制脫脂乳的產品的穩定性最差。

圖9 不同熱處理脫脂乳粉對飲料生產過程中離心沉淀率的影響Fig.9 Effect of skimmed milk powder with different heat treatments on centrifugal precipitation rate during process of beverage production

2.2.4飲料生產過程中的Lumisizer穩定性變化

采用Lumisizer穩定性分析方法可以通過對樣品中相界面的追蹤，計算出樣品體系中粒子的移動速度，測得每個樣品不穩定指數，以此來比較所測樣品體系穩定性的差異，不穩定指數越大說明體系越不穩定，見圖10。由圖10可知，在高溫褐變處理后，物料的不穩定指數大幅度上升，發酵均質及配料定容后明顯下降；以中溫脫脂乳粉為原料的產品體系不穩定指數值在整個生產過程中處于最低水平，穩定性最佳。高溫長時間熱處理使蛋白質變性，發生聚集和交聯，使蛋白質顆粒體積變大，產品穩定性下降；同時，長時間熱處理脫脂乳粉會加重美拉德反應[29]，而過度美拉德反應會促進非蛋白聚合反應，從而導致沉淀的發生而降低體系穩定性。各樣品穩定性由大到小依次為中溫乳粉、高溫乳粉、低溫乳粉、鮮制脫脂乳，與基于粒徑、zeta電位和離心沉淀率的體系穩定性結果一致。

圖10 不同熱處理脫脂乳粉對飲料生產過程中不穩定指數的影響Fig.10 Effect of skim milk powder with different heat treatments on instability index during process of beverage production

3 結 論

對不同熱處理(低溫、中溫、高溫)脫脂乳粉的理化性質研究表明：各乳粉樣品的水分、蛋白質和脂肪含量，以及乳酸度無顯著差異；隨著脫脂乳粉受熱程度的增大，其乳化性及乳化穩定性、起泡性及起泡穩定性顯著降低(P<0.05)，而其溶解性均超過99%，差異不顯著；且隨著受熱程度的增大，乳清蛋白氮指數隨原料受熱程度增加而減小，樣品粒徑從160 nm增大到426 nm。在飲料生產過程中，高溫褐變使產品穩定性下降，均質處理及配料定容使體系更穩定。因此，高溫褐變、均質處理和配料環節是影響褐色乳酸菌飲料穩定性的關鍵工藝。以不同熱處理脫脂乳為原料的產品在生產過程中的穩定性由大到小依次為中溫乳粉、高溫乳粉、低溫乳粉、鮮制脫脂乳。因此，選擇中溫脫脂乳粉作為褐色乳酸菌飲料生產原料。本研究以期為褐色乳酸菌飲料生產中選擇適宜熱處理的脫脂乳粉，優化配料及相關工藝參數，提高產品的穩定性提供一定的理論支撐。