分散固相萃取- 超低溫液液微萃取- 氣相色譜質譜法測定煙熏及燒烤肉制品中16種歐盟優控多環芳烴

童蘭艷，肖昭競，代政華，李根容，龍 梅，楊茂芹

(重慶市計量質量檢測研究院/重慶市食品安全工程技術研究中心/國家農副加工產品及調味品質量監督檢驗中心，重慶 401123)

隨著社會經濟水平的發展，肉及肉制品逐漸成為人們飲食的重要組成部分，根據聯合國糧食及農業組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)統計，在2015年全世界平均每人每年肉的消耗量是41.3 kg，發展中國家和發達國家每人每年肉的消耗量分別為31.6 kg和95.7 kg。預計到2030年人均肉消耗量將在此基礎上翻倍[1-2]。肉類具有豐富的營養成分為人體提供優質蛋白質、氨基酸、脂肪、微量元素和維生素，通過腌制、油炸、煙熏或發酵加工成肉制品來增加肉的風味或是延長肉的儲存時間。但是，在2015年10月，國際抗癌機構(International Agency for Research on Cancer,IARC)將加工肉制品培根、火腿、香腸等列為Ι類致癌物。研究證實，肉類食物在高溫加工如煙熏、燒烤、油炸時，脂肪組織發生熱解，或接觸不完全燃燒物都會產生大量的多環芳烴[3-4]。

多環芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是指兩個以上苯環以稠環形式相連的化合物，根據相對分子質量及苯環數，PAHs可以分為輕PAHs(2～4環)和重PAHs(多于4環)。目前已發現的致癌性PAHs及其衍生物已達400多種，是至今為止數量最多的一類致癌物[5]。PAHs的研究從環境領域開始，通過進一步研究發現環境中的PAHs可以通過富集轉移進入食物中，如油脂、蔬菜水果、水產品和加工肉制品[6-8]。PAHs，特別是重PAHs化學性質穩定，容易在人體、生物體和沉積物中積累，破壞人體內的遺傳物質，增加癌癥的發病率，引發癌細胞增殖，嚴重危害人類生命安全。多環芳烴通常是指16種美國國家環保局(Environmental Protection Agency，EPA)優控的多環芳烴，部分具有遺傳毒性、致癌性或潛在致癌性。2002 年由食品科學委員會(European Commission’s Scientific Committee on Food,SCF)提出的需優先控制的15種 PAHs，包括8種EPA 優控PAHs和7種新物質，在2006年，糧農組織/世界衛生組織食品添加劑聯合專家委員會(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives,JECFA)加入具有致癌性的苯并[c]芴，構成15+1種歐盟優控多環芳烴，即為本研究所述16種歐盟優控多環芳烴，均為重質多環芳烴。

目前，對16種歐盟優控多環芳烴的檢測方法的研究主要有高效液相色譜法[9]和氣相色譜- 質譜聯用法[10-11]。高效液相色譜- 熒光法(high performance liquid chromatography-fluorescence method,HPLC- FLD)廣泛用于食物中多環芳烴的檢測，是通過了美國環境保護署和歐盟食品安全局認證的檢測方法[12]，但某些多環芳烴不具備熒光吸收，導致高效液相色譜熒光法能夠測定PAHs的種類有限。而且，高效液相色譜- 熒光法分析時間長、基線易漂移等缺點，因此如何提高高效液相色譜法的檢測效率和準確度是研究的重點。氣相色譜質譜法(gas chromatography-mass spectrometry，GC- MS)測定多環芳烴是多數國家標準中使用的檢測方法[13]，GC- MS具有較高的特異性和靈敏度，是目前實驗室針對低濃度殘留物質檢測廣泛使用的檢測方法。

煙熏和燒烤肉制品本身含色素、脂肪、有機酸等多種物質，同時肉制品中PAHs含量較低，前處理常用方法為索氏提取、加壓液體萃取、固相萃取、凝膠滲透色譜凈化[14-18]，這些前處理必需再經液液萃取及固相萃取進一步凈化，而固相萃取法需用不同功能的萃取柱對色素和油脂進行凈化，存在耗時長和成本高等問題。分散固相萃取(dispersive solid phase extraction，DSPE)具有簡便、快速和成本低廉的優點，近年來在獸藥和農殘領域得到廣泛的應用和推廣[19]。本研究通過優化樣品前處理條件，對比超低溫液液萃取和常溫液液萃取效果，建立了超低溫液液萃取聯合分散固相萃取- 氣相色譜質譜同時測定煙熏及燒烤肉制品中16種歐盟優控多環芳烴的方法，并對市售臘肉、烤肉串等樣品進行了分析，結果顯示該方法準確度高，重復性好，大大減少有機溶劑的使用，節約前處理時間。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

GC- 2010 plus型氣相色譜儀配SHIMAZU QP2020型質譜儀，日本島津公司；Quintix224- 1CN型電子天平，德國Sartorius公司；Avanti J- 30I型落地式高速離心機,美國貝克曼公司；RV10型旋轉蒸發儀，德國IKA公司；DW- 86L388A型低溫冰箱，中國海爾集團。

實驗所用肉制品均為市售，樣品購回后統一均質制樣后密封于玻璃器皿中于-18 ℃條件儲存備用。實驗所用器皿均經色譜純正己烷清洗，所用試劑經過空白實驗驗證，無目標物帶入。

為了評估該前處理方法的效果，先對市售樣品進行多環芳烴含量測定實驗，確定方法確認所用樣品為陰性樣品，按實驗設計加入定量的標準溶液，渦旋混勻后，靜置2 h待標液與樣品充分混勻后，進行提取凈化實驗。根據加標樣品中測得多環芳烴含量與實際加標量的比值獲得回收率，以回收率的高低評價實驗條件優化效果和方法的可行性。

食品中多環芳烴含量測定樣品所用肉制品為市場隨機挑選10個銷售點同時采購臘肉、香腸、烤雞肉串和烤羊肉串4種產品，共40批次樣品，統一制樣后密封于18 ℃條件儲存備用。

1.2 標準溶液的配制

標準中間液的配置，乙腈為溶劑，將16種PAHs標準溶液(500 mg/L)稀釋成10 mg/L的混合標準中間溶液，置于棕色容量瓶中，于-20 ℃避光保存。

標準工作液，待儲備液恢復至室溫后，分別移取一定量的標準中間液，用乙腈稀釋至刻度，得到所需濃度的多環芳烴標液，上機制作標準曲線。

1.3 樣品處理方法

準確稱取均質試樣5.00 g(精確至0.01 g),置于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 mL乙腈，渦旋2 min，加入4.0 g硫酸鎂和1.0 g氯化鈉，震蕩5 min，超聲提取20 min，以8 000 r/min離心5 min，移出上清液，殘渣用5 mL乙腈重復提取一次，合并上清液。將提取液轉移至分散固相萃取管中(吸附劑為1 000 mg無水硫酸鎂、200 mg C18E和100 mg PSA)渦旋2 min，再以8 000 r/min離心10 min，取2 mL經分散固相萃取后的液體于10 mL比色管中后，加入1 mL甲苯，迅速振搖混勻后全部吸入氣密性注射器后迅速注入裝有8 mL去離子水的離心管中，振搖后8 000 r/min離心5 min，置于-80 ℃冰箱中冷凍30 min，取上清液上機測定。

1.4 氣相色譜條件

升溫程序：初始溫度150 ℃，保持0.8 min，以70 ℃/min升溫至200 ℃，以2 ℃/min升溫至225 ℃，以3 ℃/min升溫至255 ℃，以2 ℃/min升溫至300 ℃，以15 ℃/min升溫至315 ℃，保持10 min，進樣口溫度320 ℃，分流進樣，分流比為30∶1，線速度41.6 cm/s，傳輸線溫度320 ℃，載氣高純He，典型色譜圖見圖1。

1.苯并[c]芴(BcL);2.苯并[a]蒽(BaA);3.環戊烯[cd]芘甲(5MC);6.苯并[b]熒蒽(BbF);7.苯并[k]熒蒽(BkF);8.苯并[j]熒蒽(BjF);9.苯并[a]芘(BaP);10.茚并[1,2,3-cd]芘(IcP);11.二苯并[a，h]蒽(DhA);12.苯并[g,h,i]苝(BgP);13.二苯并[a,i]芘(DiP);14.二苯并[a,e]芘(DeP);15.二苯并[a,l]芘(DlP);16.二苯并[a,h]芘(DhP)圖1 16種歐盟優控多環芳烴標準溶液的離子流圖Fig.1 Ion chromatograms of 16 EU priority PAHs

1.5 質譜條件

離子源溫度300 ℃；電離方式電子轟擊離子(EI)源；電子能量70 eV；全掃模式(Scan)及選擇離子檢測模式(SIM)16種PAHs的質譜參數見表1。

表1 16種歐盟優控多環芳烴保留時間、特征離子及結構式Tab.1 Retention time,target ions and structures of 16 EU priority PAHs

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件的優化

為了簡化提取和優化過程，根據多環芳烴的差異，選用乙腈、丙酮和二氯甲烷作為提取溶劑，比較提取效果。分別用乙腈、丙酮和二氯甲烷對多環芳烴加標量為1.0 μg/kg的樣品進行提取，經凈化和萃取后上機測定目標物含量，根據16種歐盟優控PAHs回收率結果評價溶劑提取效果。實驗結果如圖2：從結果看，乙腈作為溶劑時，提取效果明顯高于其他溶劑。本研究中分散固相萃取主要是除去干擾的基質成分，從而達到凈化的效果。PSA吸附劑在硅膠上鍵合了乙二胺-N-丙基官能團，主要作用為極性相互作用及陰離子交換作用，可有效除去肉制品中的有機酸、脂肪和糖類物質；C18E吸附劑在硅膠上鍵合了十八烷基官能團，產生較強的非極性作用，對極性弱的脂肪酸、色素等大分子物質有較強的吸附效果；無水硫酸鎂主要吸附樣品中殘留的水分，以保證PSA的吸附能力[20-21]。故最終選擇提取效率好的乙腈作為提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑對16種歐盟優控多環芳烴的提取效率Fig.2 Extraction efficiencies of 16 EU priority PAHs with different extraction solvents

甲苯的密度比水小(ρ20 ℃=0.866 g·mL-1)，分散固相萃取液與甲苯混合后用玻璃注射器注入去離子水中，甲苯和乙腈的混合溶液以微球狀分布于水溶液中，形成穩定的乳濁液(水- 乙腈- 甲苯)，萃取相之間以微球狀接觸大大增加萃取的接觸面積，在短時間內達到液液萃取平衡，最后經高速離心得到上層萃取液甲苯，同時將在分散固相萃取時沒有完全除去的凈化鹽溶入水中。從而，極大提高萃取速率和效果。

2.2 液液萃取條件優化

16種歐盟優控多環芳烴均為重質多環芳烴，常用甲苯為萃取溶劑。乙腈的凝固點溫度為-45 ℃，而甲苯的凝固點溫度是-95 ℃，因此，萃取離心后將試管-80 ℃條件下冷凍30 min，水和乙腈冷凍固化后，得到不含水的萃取液甲苯完全實現相分離，可以直接上GC/MS測定。用乙腈對多環芳烴加標量為1.0 μg/kg的樣品進行提取，經分散固相萃取凈化后，水- 乙腈- 甲苯萃取體系在室溫、-20 ℃、-40 ℃、-80 ℃條件下冷凍30 min后上機測定目標物含量，根據16種歐盟優控多環芳烴回收率結果評價溶劑提取效果。圖3是不同溫度處理后16種歐盟優控多環芳烴回收率，可知-80 ℃條件下16種歐盟優控多環芳烴的回收率好，此外，在室溫和-20 ℃條件下液液萃取，甲苯揮發性強，實驗室彌漫著甲苯刺鼻味道，而且甲苯具有致癌性，對實驗操作人員傷害大，-40 ℃條件下乙腈和甲苯都是液態沒有實現完全相分離，用移液器移取甲苯速度慢，甲苯也有一定量的揮發。因此，-80 ℃條件冷凍，萃取液可以快速轉移至進樣瓶中密封上機測定，萃取效果好，回收率高，還避免溶劑影響實驗人員身體健康。

圖3 16種歐盟優控多環芳烴在不同溫度冷凍時的提取效率Fig.3 Extraction efficiencies of 16 EU priority PAHs with different freezing temperature

2.3 色譜條件優化

16種歐盟優控多環芳烴均為重質多環芳烴(多于4環)，相對分子質量大，在傳統非極性柱上無法完全分離，例如：苯并[b]熒蒽、苯并[j]熒蒽、苯并[k]熒蒽為同分異構體、苯并[a]蒽和環戊[cd]芘無法完全分開，影響定量結果；選用 J&W DB- EUPAH型色譜柱，所有峰形都是尖銳窄小，同分異構體基本達到基線分離，如圖1。

2.4 方法線性范圍和檢出限的確定

7個質量濃度水平的系列混合標準工作液上機測定，結果見表2，16種多環芳烴在5～500 μg/L濃度范圍內與峰面積呈現良好線性關系，相關系數均大于0.999，以信噪比(S/N)=3確定156種多環芳烴的檢出限在0.1～0.5 μg/kg，以信噪比(S/N)=10確定16種多環芳烴的定量限在0.50～1.5 μg/kg。

表2 16種多環芳烴的線性方程、檢出限和定量限Tab.2 16 EU priority PAHs equations of linear regression,LODs and LOQs

2.5 方法準確度和精密度的確定

對臘肉和烤肉串進行質量分數為0.5、1.5、5.0 μg/kg的加標回收實驗，每個水平條件進行6組平行實驗，通過回收率和精密度考察了方法的可行性，結果見表3。結果表明，16種多環芳烴的平均加標回收率范圍為75.2%～114.2%，相對標準偏差為1.84%～7.57%(n=6)，方法的精密度和準確度均符合相關標準要求。

表3 方法的回收實驗結果和精密度Tab.3 Recovery test results and precision of method

2.6 市售食品中多環芳烴檢測結果

3 結 論

研究通過優化樣品前處理方法，建立了分散固相萃取- 超低溫液液萃取- 氣相色譜質譜法測定煙熏及燒烤肉制品中16種歐盟優控多環芳烴分析方法。應用該方法對食品中16種歐盟優控多環芳烴進行檢測，整個實驗方法前處理簡單、靈敏度高，方法學指標精密度、檢出限滿足國家標準和歐盟法規對16種多環芳烴的限量要求。應用該方法對40批次市售的臘肉制品和烤肉制品中的多環芳烴進行檢測，發現部分臘肉和烤肉制品中多環芳烴含量超過GB 2762—2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》和歐盟法規No.835/2011的限量要求。希望有關部門督促相關食品企業對食品加工過程和工藝進行改進，開發綠色技術途徑，減少有害物質的產生，讓消費者吃得放心，促進傳統熏烤肉制品行業更好發展。