參芎葡萄糖注射液通過激活PI3K-Akt-eNOS信號通路對冠心病大鼠Caspase-12、ICAM-1表達的影響

周巍，馬曉峰，鄧勇，王紅，鐘侖

近年來，冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟?，CHD）發病呈明顯上升趨勢[1]。參芎葡萄糖注射液（SGI）為復方制劑，具有治療閉塞性腦血管疾病的作用，副作用較少，目前關于其治療機理的研究有限[2]。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）是一類富含半胱氨酸的蛋白酶，其中Caspase-12是其參與細胞凋亡的主要蛋白，在CHD患者中水平顯著升高[3]。細胞間黏附分子-1（ICAM-1）參與血管內皮的損傷過程[4]。PI3K-Akt-eNOS信號通路的抑制是引起心肌細胞大量凋亡損傷的機制，既往研究認為丹參具有激活PI3K-Akt通路抑制凋亡的作用[5]。本文主要探究SGI對CHD大鼠Caspase-12、ICAM-1及PI3KAkt通路的影響，探其治療機制，為臨床更好的應用SGI治療CHD提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物建模雄性Sprague-Dawley級大鼠45只（Laboratory Animal Center，中國），體重180～210 g，隨機分為對照組、模型組和SGI組3組，每組各15只。模型組和SGI組均使用高脂飲食方法建模[6]，大鼠使用高脂飼料（白砂糖20%，豬油20%，膽固醇1%，酪蛋白20%，其他為基礎飼料）喂養4周。CHD大鼠模型判斷標準：使用心電圖檢查，當Ⅱ導聯心電圖，測定J點位移＞0.1 mV時認為CHD建模成功。SGI組靜脈注射SGI（貴州景峰注射劑有限公司，國藥準字H52020703），劑量20 mg/kg 1/d，連續注射7 d，另2組注射生理鹽水進行對照。本研究中包括糖尿病誘導和犧牲手術在內的所有方案均已獲得機構動物護理和使用委員會及中國動物保護協會的批準。

1.2 觀察指標及方法

1.2.1 J點位移幅度干預后使用生理記錄儀（型號SLY-808，廣州深華）記錄各組大鼠心電圖J點位移幅度：大鼠麻醉后固定于試驗臺，將檢測點置于四肢皮下，記錄Ⅱ導聯心電圖中J點的位移。

1.2.2 蘇木精-伊紅（HE）染色將大鼠處死后取出心肌組織，立即在福爾馬林液中室溫固定24 h。胰島組織用酒精脫水并包埋于石蠟中。將樣品切成5 μm厚的薄片置于APES涂覆的載玻片上。使用二甲苯將切片脫石蠟并水合并用HE試劑染色，將蘇木精在室溫下溫育5 min。洗滌后，將曙紅在室溫下溫育1～3 min，用梯度乙醇洗滌后，中性凝膠密封。

1.2.3 心肌細胞凋亡情況大鼠處死后收集心肌組織細胞，使用流式細胞術用于檢測細胞凋亡。凋亡試劑盒購自BD Pharmingen（USA），按照說明書分別加入PE及7-AAD，應用流式細胞儀（Becton Dickerson，SanJose，CA，USA）計算細胞凋亡率。

1.2.4 Western Blot使用Western Blot檢測大鼠干預后的心肌組織中Caspase-12、ICAM-1、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）及PI3K-Akt-eNOS通路蛋白的表達水平。在液氮的保護下裂解細胞，在12 000 rpm，4℃下離心15 min收集上清液，使用BCA方法繪制標準曲線以確定蛋白質濃度。使用10%的SDS-PAGE凝膠并用于電泳，電泳后使用PVDF膜進行轉膜（Bio-Rad，USA）并在室溫下用5%無脂牛奶封閉2 h。加入一抗室溫震蕩2 h后，4℃孵育過夜，加入二抗，室溫下孵育1.5～2 h，使用ECL試劑（Huiying，Shanghai，China）進行化學發光檢測。使用GAPDH作為內參，相關試劑均購于美國Abcam公司。

1.2.5 RT-PCRRT-PCR用于檢測組織中Caspase-12、ICAM-1、TNF-α和IL-6的表達水平。將組織在液氮保護下研磨并裂解，用Trizol法提取組織總RNA并溶解于DEPC水（Sigma）中。使用逆轉錄試劑盒（TaKaRa，Japan）對RNA樣品進行逆轉錄測定以合成cDNA。逆轉錄反應條件為37℃，反應15 min，逆轉錄酶失活條件為85℃，反應15 s。用SYBR Prellix Ex TaqTM實時PCR試劑盒（TaKaRa，Japan）進行RT-qPCR實驗。通過在95℃下激活DNA聚合酶5 min進行PCR，進行40個循環的兩步PCR（95℃ 10 s和60℃ 30 s），最終延伸75℃ 10 min，保持在4℃。所有引物均獲自Genewiz（中國江蘇蘇州）公司，使用2-ΔΔCT法分析mRNA表達。

1.3 統計學處理使用SPSS 19進行統計學分析。計量資料以平均值±標準偏差（）表示。三組樣本單因素對比采取方差分析（ANOVA）評估組間差異。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠心肌組織HE染色結果將三組大鼠心肌組織切片進行HE染色，在顯微鏡下觀察。結果顯示，對照組心肌細胞形態正常，心肌細胞排列整齊緊密；模型組大鼠心肌細胞核仁出現變性或成簇狀排列，心肌纖維排列紊亂、間隔增寬，間質淋巴細胞浸潤；SGI組心肌細胞核仁清晰，細胞水腫情況不明顯，纖維排列緊密（圖1）。

2.2 三組大鼠J點位移情況和心肌細胞凋亡率比較與對照組相比，模型組的J點位移幅度和心肌細胞的凋亡率明顯增高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，SGI組的J點位移幅度和心肌細胞的凋亡率均明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），表1。

圖1 三組大鼠心肌HE染色情況（A：對照組；B模型組；C：SGI組）

表1 三組大鼠J點位移情況和心肌細胞凋亡率比較（）

表1 三組大鼠J點位移情況和心肌細胞凋亡率比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

2.3 三組心肌組織Caspase-12、ICAM-1比較與對照組相比，模型組心肌細胞的Caspase-12、ICAM-1的蛋白和mRNA表達水平均明顯增高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，SGI組的心肌細胞Caspase-12、ICAM-1的蛋白和mRNA表達水平均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），表2和圖2。

2.4 三組大鼠PI3K-Akt-eNOS通路比較與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中PI3K蛋白、p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS水平均顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，SGI組大鼠心肌組織中PI3K蛋白、p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS表達水平均明顯增高，差異均有統計學意義（P＜0.05），表3和圖3 。

3 討論

隨著我國人口老齡化加劇和生活水平提高，CHD發病率也逐年升高。冠心病發展至后期會出現心力衰竭、心肌梗死等疾病，嚴重威脅人們生命健康?？寡“逅幬锖驼{脂藥物是治療冠心病的主要方法，由于冠心病病程較長，需長期服用藥物，中藥因其具有較好的療效和較低的不良反應引起了更多學者的重視[7]。

SGI主要成分包括川芎和丹參，主要有效活性物質為鹽酸川芎嗪及丹參素，具有調節氧化應激、消炎等作用，在治療心血管疾病中有著廣泛應用[8]。本研究結果顯示建模后J點位移幅度顯著升高并高于0.1 mV，同時模型組的心肌纖維細胞排列整齊緊密；模型組大鼠心肌細胞核仁出現縮變性或成簇狀排列，出現細胞水腫和淋巴細胞浸潤，心肌纖維排列紊亂、間隔增寬，說明心肌細胞受損，提示大鼠CHD模型建立成功。而SGI組的心肌細胞核仁清晰，細胞水腫情況不明顯，纖維排列緊密，J點位移幅度顯著降低，證明靜脈注射SGI具有治療CHD保護心肌細胞的作用。過往研究結果顯示SGI在治療CHD不穩定型心絞痛中具有較好的臨床效果，可緩解心肌組織纖維化、改善心臟功能[9]，同時顯示SGI具有較高的安全性[10]，說明SGI具有治療CHD和保護心肌細胞的作用。

表2 三組心肌組織Caspase-12、ICAM-1比較（）

表2 三組心肌組織Caspase-12、ICAM-1比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

圖2 三組大鼠心肌組織Caspase-12、ICAM-1蛋白和mRNA的表達水平比較（A：蛋白電泳圖；B：mRNA電泳圖）

表3 三組大鼠PI3K-Akt-eNOS通路比較（）

表3 三組大鼠PI3K-Akt-eNOS通路比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

圖3 三組大鼠PI3K-Akt-eNOS通路蛋白表達比較

Caspase-12隸屬于Caspase蛋白家族，Caspase-12的激活可通過激活下游的Caspase-3等凋亡執行因子誘導心肌細胞凋亡，過往有研究顯示丹參具有下調Caspase-12水平而發揮抗凋亡的作用[11,12]。ICAM-1具有黏附單核細胞等炎性細胞與內皮細胞的作用，從而釋放炎癥因子引起動脈粥樣硬化。ICAM-1是炎性細胞向粥樣斑塊游走和浸潤的必要條件，過往研究顯示ICAM-1與CHD的發生相關[13]。本研究結果顯示模型組心肌細胞的Caspase-12、ICAM-1蛋白和mRNA的表達水平顯著高于對照組，SGI組的心肌細胞的Caspase-12、ICAM-1蛋白和mRNA的表達水平顯著低于模型組，且模型組的心肌細胞的凋亡率顯著高于對照組，SGI組的心肌細胞的凋亡率顯著低于模型組，提示SGI可顯著抑制心肌細胞中Caspase-12、ICAM-1的水平，并抑制細胞凋亡，治療CHD。

為進一步探究SGI治療CHD的機理，我們檢測了炎癥因子和PI3K-Akt-eNOS信號通路的影響。過往研究顯示PI3K-Akt-eNOS通路在CHD中發揮著極為重要的作用。一方面，PI3K-Akt通路的抑制會通過上調Caspase-12、Caspase-3等凋亡蛋白誘導細胞凋亡；另一方面，PI3K-Akt-eNOS通路的抑制影響NO的釋放，加劇心臟動脈的縮血管效應，加重冠脈粥樣斑塊形成加劇心肌缺血，此外，PI3K-Akt-eNOS通過炎性通路影響動脈粥樣硬化的形成[14,15]。本研究結果顯示模型組大鼠心肌組織中PI3K蛋白、p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS水平顯著降低，SGI組PI3K蛋白、p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS顯著高于模型組。過往研究顯示，丹參飲提取物A通過上調PI3K-Akt信號通路水平起到抗心肌缺血的作用[16]。劉楊等[17]研究顯示丹參具有激活PI3K-Akt-mTOR信號通路的作用。楊洋等[18]研究結果顯示SGI具有保護細胞免受氧化應激損傷的作用。本研究結果顯示SGI可能通過上調PI3K-Akt-mTOR信號通路的活化水平發揮抑制心肌細胞凋亡的作用，從而治療CHD。

綜上所述，SGI具有保護心肌細胞、抑制CHD引起的心肌細胞凋亡的作用，同時SGI可有效降低Caspase-12、ICAM-1的水平治療CHD，可能是由于SGI中的活性物質具有上調PI3K-AkteNOS通路的作用有關。