大豆與叢枝菌根真菌共生建立及菌根檢測方法的探究

謝麗萍,黃詩宸,許張珂,李友國,林會

農業微生物學國家重點實驗室/華中農業大學生命科學技術學院，武漢430070

叢枝菌根 (arbuscular mycorrhiza，AM) 真菌屬于古老真菌門，可以與80%～90%的高等植物形成互惠共生的關系[1]。它不僅能改善宿主的營養狀況，尤其是磷營養，同時也能賦予宿主植物對病原體和非生物脅迫的耐受性[2-3]。隨著AM真菌研究的深入，AM真菌與宿主植物共生的分子機制已成為菌根研究的熱點。與植物營養生理方面的研究相比，AM真菌與植物共生的分子機制研究對菌根試驗材料的要求更高。一般來說，AM真菌侵染程度越高，共生結構形成越豐富，越有利于共生相關基因表達差異的檢測，這就需要建立更適合菌根形成的共生培養體系。

AM真菌屬于專性營養菌，無法純培養，只能通過活體植物對其進行繁殖[4]。到目前為止，盆栽培養法仍然是最廣泛和最可靠的菌劑擴繁以及菌根實驗的方法[5]。盆栽培養法中，培養基質是繁殖菌種和培養宿主的唯一介質，是盆栽培養最關鍵的影響因素。盡管AM真菌可以在不同的培養基質中與宿主共生[6]，但理想的培養基質可以為AM真菌的生長、侵染和共生提供理想的物理和化學條件，進而促進AM真菌的定殖[7]。陳寧等[8]以高粱為宿主，檢測4種不同的培養基質對AM真菌(Glomusmosseae93)發育的影響，證明了沙土混合物(V沙∶V土=3∶1)對高粱的生長和AM真菌(G.mosseae)的生長發育最為理想。因此，針對不同的宿主植物，選擇合適的盆栽培養基質，能更有利于AM真菌的侵染及共生結構的形成，為AM真菌和植物互作的分子機制研究提供更優良的實驗材料。在眾多與AM真菌共生的植物中，作為世界上最重要的糧食作物和蛋白質來源之一的大豆，一直受到學者的關注。AM真菌在促進大豆共生固氮以及提高大豆地上部分的氮磷積累方面具有顯著的作用[9]。因此，篩選合適的培養基質，促進大豆與AM真菌共生體系的建立，是AM真菌與大豆共生機制研究成功的重要基礎。

在AM共生的分子機制研究中，觀察和測定AM真菌在侵染宿主植物的不同時期形成的一些特殊結構，如叢枝和泡囊等，能更好地了解AM真菌與植物的共生狀態[10]。目前，菌根共生狀態觀察和測定的一般流程為：KOH菌根透明-菌根染色和脫色-菌根制片觀察和統計。在這個過程中，不同植物類型及老幼程度不同根段KOH處理的時間、染色劑的選擇及菌根統計方法的選擇都會影響菌根的觀察和統計結果。如覃曉娟等[11]探討了5種真菌染色劑對香蕉根系 AM 真菌的染色效果，證明5%醋酸墨水染液更適用于香蕉根系真菌的染色和觀察。此外，Füzy等[12]對150多篇涉及宿主根中AM真菌測定方法的論文進行了統計，發現其中37%、22%和17% 的科學著作分別采用了網格線相交法[13]、放大網格交叉法[14]和Trouvelot五級分級法[15]，同時，探討了這3種測定方法的適用范圍，認為網格線相交法只適合快速檢測真菌的存在與否，不適合對真菌特征結構進行觀察和統計，而其他2種方法都能對這些特殊的結構進行估計。在現今的基因研究方法中，全基因組關聯分析(GWAS)已成為重要的研究方法之一。因此，如何更便捷有效地觀察統計大批量菌根樣品成為需要解決的首要問題。本研究從培養基質和檢測方法的角度入手，以AM真菌Rhizophagusirregularis作為菌劑，檢測不同培養基質條件下的AM真菌的共生表型，以期為大豆與AM真菌共生的盆栽培養找到侵染周期短、侵染率高、有利于大豆生長的培養基質，同時探討適合大批量菌根測定，且簡單快速、容易操作及客觀準確的菌根檢測技術，為AM真菌與大豆共生互作的分子機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的3個大豆品種分別是天隆1號(原產地湖北)、冀豆17(原產地為河北)和威廉82(原產地美國)，由華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室提供。

供試AM真菌(R.irregularis)接種劑由農業微生物學國家重點實驗室保存。該接種劑是以紫云英為宿主擴繁10個月后獲得，接種劑包含AM真菌的孢子、根外菌絲、AM真菌侵染的根段以及根際土壤混合物。每10 g接種菌劑內約含(60±3)個健康有活力的孢子。

盆栽基質采用蛭石、土、沙等3種原材料通過不同比例混配獲得，共4種處理：①蛭石；②蛭石-土(V蛭石∶V土=4∶1)；③沙-蛭石(V沙∶V蛭石=1∶1)；④沙-土(V沙∶V土=4∶1)，其中蛭石和沙購自武漢友納生物科技有限公司，土取自華中農業大學試驗田。

1.2 大豆盆栽方法

試驗采用雙因素區組試驗，以不同原產地的3個大豆品種作為宿主，分別種植于4種不同的基質中，共設計12個處理，每個處理重復5次。采用直徑16 cm、高13 cm 的塑料花盆作為培養容器。

種植和接種AM真菌前，提前用巴氏消毒液對培養的溫室、苗床進行消毒，所有用到的培養器皿都于121 ℃間歇高壓蒸汽滅菌3次，每次1 h。種子滅菌前，挑選飽滿、均一、健康的大豆種子，并用氯氣滅菌12 h，播種前在超凈臺放置30 min，除掉殘余氯氣。將混合基質與AM真菌接種劑按10∶1的比例混合均勻后裝到花盆中，播種。播種完成后，將大豆置于光照培養室(24～28 ℃，16 h光照/8 h暗期)生長。試驗期間每周定量澆灌1次低磷Hoagland營養液(磷濃度為20 μmol/L)，每次澆100 mL，其余時間水分補足，每個穴盤每次澆水量以穴盤水不向外滲漏為準。

1.3 樣品收獲及分析測定

取滅菌處理后的混配基質樣品100 g，烘箱烘干后測定混合基質的理化性質。取混合基質20 g浸于100 mL去離子水中，3 h后取濾液，測定pH值。將烘干基質粉碎，并過孔徑0.5 mm篩網，用H2SO4-H2O2消煮后，使用凱氏定氮法測定氮含量；HClO4-H2SO4消煮后，比色法測定全磷含量；原子吸收光譜法測定鉀含量。

收獲后，先測定植株地上部分和根系總鮮質量。再將根系分為兩部分，第一部分樣品用于測定真菌菌根共生指標；第二部分根樣與地上部分一同置于60 ℃烘箱中烘干48 h，分別測定干質量。

菌根共生指標統計采用放大網格交叉法[14]和Trouvelot[15]五級分級法。

1.4 數據分析

采用SPSS(v25.0)統計軟件對大豆植株的生物量以及真菌侵染率、叢枝、根菌絲和泡囊等共生指標進行雙因子方差分析(Two-way ANOVA)，采用LSD法進行顯著性檢驗，使用Origin 9軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 不同基質對大豆與叢枝菌根真菌共生的影響

1)培養基質的理化性狀。蛭石、蛭石-土(V蛭石∶V土=4∶1)、沙-蛭石(V沙∶V蛭石=1∶1)、沙-土(V沙∶V土=4∶1)4種基質的理化性質如表1所示，不同基質在有機質、總磷、速效磷、速效鉀含量上均有較大差異。其中，蛭石-土中有機質含量最高，其次是沙-土、蛭石，蛭石-沙中最低?？偭缀坑筛叩降鸵来问球问?土、蛭石-沙、沙-土、蛭石。有效磷含量在蛭石-土中最高，其次是沙-土、蛭石，蛭石-沙中最低。速效鉀含量在蛭石-土中最高，其次是蛭石、沙-土，蛭石-沙中最低。4種基質的酸堿度相差不大，pH值為6.46～9.29。結果顯示，4種混合基質的營養成分都較貧乏，尤其是有效磷的含量無法滿足大豆正常生長的需要，這可能有助于AM真菌的侵染和共生。

表1 4種基質的理化性狀Table 1 Physical and chemical properties of 4 substrates

2)不同基質接種AM真菌后大豆生長狀況。將天隆1號、冀豆17和威廉82等3個品種的大豆分別種植在接種AM真菌的4種基質中，觀測其生長狀況。結果顯示，不同基質中大豆的地上部生物量隨著接種時間的延長而增加(圖1)。在前期(接菌后7、14 d)，不同基質中大豆的地上部生物量增加趨勢基本一致。從接菌后21 d開始，不同品種大豆在4種基質中地上部生物量開始出現差異。接菌28 d和35 d時，蛭石-土與沙-土中生長的大豆植株，其地上部生物量都顯著高于其他2種基質，相對于沙-土而言，蛭石-土更有利于大豆的生長。大豆的地下部生物量的測定結果顯示其與地上部分生物量具有相同的變化趨勢。接菌28～35 d，蛭石-土中大豆的地下部生物量顯著高于其他3種基質。接菌后35 d時，沙-土中大豆的地下部生物量也有所增加，并顯著高于其他2種基質，但是仍然低于蛭石-土。這表明不同的基質處理對于大豆的生長均有顯著的影響，其中，蛭石-土與沙-土這2種基質更適合大豆的生長，尤其在蛭石-土中，大豆的長勢更好。此外，不同的大豆品種在不同基質中的生長趨勢一致，表明不同處理之間生物量的差異主要是受到培養基質的影響。

A：地上部分生物量； B：地下部分生物量； Ⅰ:天隆1號；Ⅱ：冀豆17； Ⅲ:威廉82；不同字母表示組間有差異(P<0.05)，相同字母表示無差異(P>0.05)，誤差線代表5個獨立樣品的標準偏差。A:Shoot dry biomass; B:Root dry biomass. Ⅰ：Tianlong 1； Ⅱ：Jidou 17； Ⅲ:William 82; Different letters indicate that there is a difference between the two groups(P<0.05),and the same letter indicates that there is no significant difference between the two groups(P>0.05). The error bars represent the standard deviations of five independent samples.圖1 不同基質中大豆生物量的變化Fig.1 Changes of soybean biomass in different substrates

3)不同基質中AM真菌的共生表型。AM真菌生長狀態可以很好地指示共生關系。AM真菌在4種基質中的侵染率隨著接種天數的延長而增加(圖2)。接菌后7 d，不同基質之間的侵染率沒有太大差異。14 d時，蛭石-土中大豆菌根的侵染率就已經顯著高于其他3種基質，28 d時達到最大值。其他3種基質中，AM真菌的侵染率增長趨勢由高到低依次是沙-土、沙-蛭石，在蛭石中侵染最緩慢。從接菌后21 d開始，蛭石-土中大豆菌根的侵染率緩慢增加到最大值，僅有輕微的波動，至35 d時，4種基質中AM真菌的侵染率都達到最大值(圖2A)。表明培養基質能顯著影響AM真菌對大豆的侵染，而蛭石-土更有利于AM真菌的侵染。相比其他3種基質，在蛭石-土中AM真菌的侵染周期更短，侵染率在21 d就已接近峰值。

叢枝是AM真菌與宿主植物進行營養交換的重要共生結構，它能夠很好地表征宿主與真菌之間營養交換的狀態。如圖2B所示，隨著接種時間的延長，蛭石-土中大豆根系皮層細胞內叢枝豐度先明顯增加，并且在接種后 28 d時出現峰值，而后略有降低。表明在接菌28 d后，蛭石-土中菌根細胞內的叢枝已經開始降解。而其他3種基質中菌根細胞內的叢枝豐度與蛭石-土中具有一樣的增長趨勢，但在整個培養期間均顯著低于蛭石-土。

基質也對AM真菌根內菌絲豐度有影響(圖2C)。不同基質中菌根的菌絲量隨著接種時間的延長而增加，在培養結束時基質中的菌絲量達最大值。從接菌后14 d開始，蛭石-土的菌根中菌絲豐度總是高于其他3種基質，沙-土的菌根中菌絲豐度僅次于蛭石-土，蛭石與沙-蛭石的菌絲豐度最低。

AM真菌的泡囊豐度也受到基質處理的影響(圖2D)。不同基質中的泡囊豐度也隨著接種時間的延長而增加。在AM真菌與宿主大豆剛開始建立共生時，無泡囊結構，接菌后 14 d時，開始發現有少量泡囊形成。與其他3種基質相比，蛭石-土中大豆根系的泡囊先于其他3種基質出現，而且顯著高于其他3種基質，直到培養結束。其次是沙-土，蛭石與沙-蛭石最低。

A：侵染率； B：叢枝豐度；C：菌絲豐度；D：泡囊豐度；Ⅰ:天隆1號；Ⅱ：冀豆17； Ⅲ:威廉82； 不同字母表示兩組間有差異，相同字母表示無差異，差異在α=0.05的顯著水平，誤差線代表5個獨立樣品的標準偏差。A:Percentage root colonization. B:Arbuscule abundance. C:Hyphe abundance. D:Vesicle abundance.Ⅰ：Tianlong 1； Ⅱ：Jidou 17； Ⅲ:William 82; Different letters indicate that there is a difference between the two group,and the same letter indicates that there is no significant difference between the two group,and significant difference at α=0.05.The error bars represent the standard deviations of five independent samples.圖2 不同基質對AM真菌共生的影響Fig.2 Effect of different substrates on the growth of AM fungi

綜上，蛭石-土的混合基質有利于AM真菌菌絲的生長、延伸，使其更容易侵染大豆根部，形成叢枝和泡囊等共生結構。此外，AM真菌的共生表型在3個不同的大豆品種之間沒有顯著差異，說明共生表型的差異與大豆品種并無直接相關性。

2.2 大批量大豆菌根檢測方法的探究

1)不同時期菌根樣品KOH處理時間的探索。菌根樣品的透明效果和染色效果是共生指標統計結果準確性的重要因素。菌根的透明效果不理想會導致共生指標的錯誤判斷，尤其在共生后期，許多共生結構都重疊在一起，最終影響測定結果的準確性。因此，本研究分別對接種后7、14、21、28、35 d的大豆菌根進行了KOH處理時間的摸索，根據染色結果確定了樣品透明效果最佳的處理時間分別為10、15、30、40、50 min。

2)大豆菌根染色方法的探究。菌根染色效果的好壞也會影響菌根共生指標統計結果的準確性。通過比較臺盼藍和Parker墨水染色方法(圖3)，發現經臺盼藍染色的真菌結構染色效果可靠穩定，染色樣品不易掉色，可以長期保存，但經臺盼藍染色的根樣，在脫色時經常會出現真菌結構和皮層細胞的同步脫色，導致根部皮層細胞被染上與真菌相同或者略淺的顏色，共生結構不明顯，影響真菌結構的觀察與檢測(圖3 A)。采用Parker墨水染色時，真菌結構著色十分牢固，不會出現同步脫色的現象，而且根中的菌絲、叢枝和泡囊等結構的形態特征明顯，易于觀察與統計(圖3 B)。

A：臺盼蘭染色； B：Parker墨水染色；圖中紅色箭頭指向AM真菌在大豆根部的結構，其中A：叢枝；AP：附著胞；H：菌絲；V：泡囊。A:Trypan blue staining; B:Parker ink staining. The red arrow in the picture points to the structure of AM fungi at the root of soybean. A：Arbuscule; AP：Appressorium; H：Hypha; V：Vesicle.圖3 菌根染色方法的比較Fig.3 Comparison of mycorrhizal staining methods

3)菌根共生指標檢測方法的探究。通過2種不同的檢測方法來測定AM真菌在大豆威廉82根中的侵染率、叢枝豐度以及泡囊豐度。如圖4所示，放大網格交叉法與Trouvelot五級分級法統計的侵染率結果相似，但是Trouvelot五級分級法的平行樣本之間的標準差在不同基質中普遍大于放大網格交叉法 (圖4 B)。叢枝豐度的結果顯示，Trouvelot五級分級法的統計結果比放大網格交叉法的統計結果小。同時，在不同基質中，叢枝豐度的標準差也普遍高于放大網格交叉法 (圖4 D)。泡囊豐度的統計結果也相差不大，但平行樣本之間的標準差在4種基質中的變化不同 (圖4 F)?？傮w來看，這2種方法都能準確地測定真菌結構，但是由于放大網格交叉法測定過程所產生的標準差普遍低于Trouvelot五級分級法，說明放大網格交叉法的統計值更接近真實值。

3 討 論

AM真菌與宿主植物共生的建立與培養基質的理化性質密切相關[8]。本研究結果顯示，在蛭石-土中，大豆的生物量以及AM真菌的侵染率、叢枝豐度、菌絲豐度和泡囊豐度都是最高的。一般來說，基質養分含量過高或者過低都不利于宿主植物與AM真菌共生的建立，尤其是有機質的含量[16]。本研究用到的4種混合基質都屬于營養貧乏的基質，與其他3種基質相比，蛭石-土中有機質、全氮、全磷的含量都相對較高。該基質中大豆的地上和地下部分生物量的顯著增加，說明這種基質的養分條件適合大豆的生長。同時，該基質中AM真菌在不同時期的侵染率均顯著高于其他基質，并且能較早地到達侵染高峰，表明該基質更有利于AM真菌的侵染以及叢枝、菌絲和泡囊等共生結構的形成，使得大豆與AM真菌能更早地進行營養交換，最終促進大豆生長。反之，其他3種基質中的養分含量較低，不利于共生體系的建立，尤其是蛭石與沙-蛭石基質。盡管蛭石中的營養成分比蛭石-沙中稍高，但是該基質中的AM真菌的生長發育并不好，可能是基質的其他因素造成的，比如基質的通氣狀況和水分狀況等[17]?？傮w來看，蛭石-土中AM真菌的侵染速度和生長發育都高于其他3種基質，表明該基質有助于AM真菌菌絲延伸侵染以及叢枝形成。此外，蛭石和土這2種材料都容易獲得，質地較輕，便于操作。因此，蛭石-土這種基質可以作為大豆與AM真菌共生分子機制研究的最佳盆栽培養基質。

A：侵染率； B：A圖中5個重復樣本的SD值； C：叢枝豐度；D：C圖中5個重復樣本的SD值； E：囊泡豐度； F： E圖中5個重復樣本的SD值。A:Percentage root colonization; B:SD values of five repeated samples about A; C:Arbuscule abundance; D:SD values of five repeated samples about C; E:Vesicle abundance; F:SD values of five repeated samples about E.圖4 放大網格交叉法和Trouvelot五級分級法的比較Fig.4 Comparison of the magnified intersections method and the five class of Trouvelot method

在AM共生的分子機制研究中，AM真菌在宿主根中的狀態可以很好地指示AM真菌與宿主的共生狀態和共生時期[12]。目前，確定共生狀態最常用的方法是AM真菌與宿主共生的染色根樣品的顯微觀察和統計[18]。在菌根的顯微觀察中，菌根染色效果對于共生指標準確性的統計尤為重要。目前菌根染色的染色劑除了墨水之外，其他的幾種染料都被國際癌癥研究機構列為可能或者可疑的致癌物[19]。本研究選擇最常用的臺盼蘭染色劑和安全無毒的墨水染色劑進行了比較，結果發現，經臺盼藍染色的根系皮層組織經常會被染上相同而略淺的顏色，使得 AM 真菌的結構與皮層組織顏色反差不大，不利于結構的觀察，這與Phillips等[20]的結果一致，而且臺盼蘭具有致癌作用，安全性不高。而經墨水染色的AM真菌結構著色很深，與背景反差大，染色效果極佳，很少會出現根皮層組織被染色的情況。同時它還具有操作簡便、毒性小、成本低等特點。該結果與汪茜等[21]的結果相似。因此，對于大批量大豆菌根的測定，墨水染色法絕對是一種比較理想的染色方法。它不僅能提供很好的染色效果，而且也是一種比較經濟、安全的染色方法。

在菌根的顯微統計中，共生指標的統計方法也是影響統計結果準確性的一個重要因素。目前，常用的3種統計方法中，由于網格線相交法只能檢測真菌的存在與否，不能檢測真菌的特征結構，本研究只對放大網格交叉法和Trouvelot五級分級法進行了比較。結果表明，放大網格線交叉法和Trouvelot五級分級法對于AM真菌侵染率、叢枝豐度和泡囊豐度的最終統計結果相差不大，說明這2種方法都能對根中真菌結構進行準確的估計。同時我們也發現放大網格交叉法的標準差普遍低于Trouvelot五級分級法，推測原因可能是：(1)放大網格交叉法的評價方法比Trouvelot五級分級法更加客觀，對人的主觀依賴性??；(2)放大網格交叉法的統計樣品比Trouvelot五級分級法多，可能會導致誤差降低。此外，與放大網格交叉法相比，Trouvelot五級分級法對叢枝的測定結果偏小，這可能是因為叢枝結構的外觀并不像孢子和泡囊那樣容易辨別，很難在其他結構之間準確地區分出叢枝，所以在快速掃描整條根樣時，Trouvelot五級分級法不能像放大網格交叉法估計固定點那樣對所有的叢枝都能進行準確地估計，最終導致Trouvelot分級法對叢枝的統計結果被低估。盡管這2種方法都能對根中真菌結構進行準確地測量，而且花費的時間都相同，但是放大網格交叉法平行樣本之間的標準差普遍低于Trouvelot五級分級法，可以認為放大網格交叉法的測定結果更接近真實值。因此，對于大批量大豆菌根檢測，放大網格交叉法可以作為一種簡單快速、容易操作且客觀準確的菌根檢測技術。