甲基轉移酶樣蛋白14介導長鏈非編碼RNA EIF3J反義RNA1對膽管癌細胞遷移和侵襲的影響

歐陽柳 鄭浩 程文英 陶元平 李慧芬 李小玲 張雷 李勃 郭世偉 胡先貴 金鋼

1海軍軍醫大學第一附屬醫院普外三科，上海 200433；2海軍軍醫大學第三附屬醫院肝外三科，上海 200433；392493部隊醫院內三科，葫蘆島 125003；4海軍軍醫大學第三附屬醫院介入科，上海 200433；592493部隊醫院門診部，葫蘆島 125003

膽管癌根據膽管的解剖位置可分為肝內膽管癌和肝外膽管癌，通常確診晚，常伴有腫瘤血管侵犯和淋巴結轉移，導致預后較差[1-3]，患者的5年生存率只有20%～30%[4]。目前為止，膽管癌發生和進展的確切分子機制尚不完全清楚。RNA表觀遺傳修飾是RNA調節基因表達的化學基礎，N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)是真核生物信使RNA(messenger RNA, mRNA)中含量最豐富的轉錄后修飾之一，約占總修飾的50%[5]，其修飾的生成依賴于甲基轉移酶樣蛋白14(methyltransferase-like protein 14，METTL14)。METTL14是m6A甲基化修飾酶的重要編碼器，在多種腫瘤的發生和進展中發揮重要作用[6]。研究表明，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)在腫瘤細胞的增殖、侵襲和凋亡調控中也起著關鍵作用[7-10]。lncRNA EIF3J反義RNA1(antisense RNA1，EIF3J-AS1)首次報道在肝細胞癌腫瘤樣本中顯著上調[11]，并且其表達異常與食管癌和結腸癌等的發生與進展密切相關[12-13]。通過在線數據庫GEPIA(http://gepia.cancerpku.cn/)證實METTL14與lncRNA EIF3J-AS1(lnc EIF3J-AS1)在膽管腫瘤組織中表達呈正相關，但METTL14是否直接介導lnc EIF3J-AS1在膽管癌腫瘤中異常表達，從而促進膽管癌的發生仍尚未完全明確。本研究擬探討METTL14介導lnc EIF3J-AS1促進膽管癌進展的潛在分子機制。

材料與方法

一、膽管癌組織METTL14 mRNA和lnc EIF3J-AS1表達檢測

收集2017年9月至2018年12月間海軍軍醫大學第一附屬醫院普外三科行手術切除并經病理學證實的10例原發性膽管癌患者的癌組織和對應的癌旁正常組織(距離腫瘤組織邊緣>2 cm)，其中男性9例，女性1例，年齡(52±8)歲。所有樣本離體后即刻置液氮冷凍，于-80℃冰箱保存。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

應用Trizol法抽提膽管癌組織及癌旁組織總RNA,采用RNA逆轉錄與擴增試劑盒(日本TaKaRa公司)轉錄cDNA，再用GreenTMTB Premix Ex TaqTM(T1iRnaseH P1us，日本TaKaRa公司)行實時熒光定量PCR反應，按試劑盒說明書操作，以GAPDH為內參。METTL14正向引物序列為5′-ACTTGCTGGGTACAAGTA-3′，反向引物序列為5′-CCTTCTGATGCTTGTCTGTT-3′；lnc EIF3J-AS1正向引物序列為5′-GTCAGATTTTGTCCGTTCA-3′，反向引物序列為5′-CATGGACTTGACGTAGCTGTT-3′；內參GAPDH正向引物序列為5′-GGAGTTACTTCTATGCCTGA-3′，反向引物序列為5′-TTCATGGGGAGGTACAAC-3′。反應條件：95℃預變性10 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s，共40個循環。通過儀器自帶軟件獲取Ct值，應用 2-△△CT公式計算METTL14 mRNA和lnc EIF3J-AS1的相對表達量，每個樣品設3個復管，取均值。

二、膽管癌組織METTL14蛋白表達檢測

采用人蛋白裂解液(美國Roche公司)裂解膽管癌組織及癌旁組織，抽提總蛋白，應用BCA法定量后常規行蛋白質免疫印跡法檢測METTL14蛋白表達，以actin為內參?？筂ETTL14抗體(1∶1 000)購自英國Abcam公司(ab220030)，HRP二抗(1∶3 000)購自武漢博士德生物科技有限公司。最后ECL發光， X片曝光、顯影、定影。用Image J軟件掃描，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。

三、膽管癌HUCCT1和RBE細胞METTL14 mRNA和lnc EIF3J-AS1表達檢測

膽管癌細胞株HUCCT1和RBE均取自中國上?？茖W院細胞庫，常規復蘇及培養傳代。取對數生長期細胞接種于96孔板，分為HUCCT1對照組和HUCCT-METTL14組，RBE對照組和RBE-METTL14組。兩對照組分別轉染相應的陰性對照的慢病毒，兩METTL14組分別轉染相應的干擾METTL14表達的慢病毒。所有慢病毒均購自上海吉瑪生物制藥有限公司。慢病毒轉染按慢病毒轉染試劑盒說明書操作，并篩選出穩定轉染的細胞株。取上述4組穩定轉染的對數生長期細胞，按前述的實時熒光定量PCR檢測各組細胞METTL14 mRNA和lnc EIF3J-AS1表達量。

四、膽管癌HUCCT1和RBE細胞遷移和侵襲能力檢測

同上法將膽管癌細胞株分為HUCCT1對照組和HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組，RBE對照組和RBE-lnc EIF3J-AS1組。兩對照組分別轉染相應的陰性對照慢病毒，兩lnc EIF3J-AS1組分別轉染相應的干擾lnc EIF3J-AS1表達的慢病毒。應用Transwell小室(美國Corning公司)實驗檢測細胞遷移能力。將Transwell小室隔膜上面用凝膠覆蓋后檢測細胞侵襲能力。將含1×105個細胞的100 μl無血清培養液加入Transwell小室的上室，下室加入含有10%胎牛血清的DMEM細胞培養液500 μl，培養24 h后取出小室隔膜，用棉簽輕輕擦去隔膜上面未穿膜的細胞，用4%多聚甲醛室溫固定隔膜30 min，PBS洗3次，1.5%亞甲藍染色，室溫干燥，在顯微鏡下觀察5個高倍鏡視野，計算每個視野的穿膜細胞數，取均值。

五、膽管癌HUCCT1和RBE細胞EGFR和AKT蛋白表達檢測

收集HUCCT1對照組、HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組、RBE對照組、RBE-lnc EIF3J-AS1組對數生長期細胞，裂解提取細胞總蛋白，按前述的蛋白質免疫印跡法檢測表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、AKT、磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表達，以actin為內參?？笶GFR抗體(1∶1 000，ab52894)、p-AKT 抗體(1∶2 000，ab38449)、AKT抗體(1∶2 000，ab8805)均購自英國Abcam公司，HRP二抗(1∶3 000)購自武漢博士德生物科技有限公司。p-AKT、AKT蛋白表達以兩者的比值表示。

六、統計學處理

結 果

一、膽管癌組織和癌旁組織METTL14、lnc EIF3J-AS1表達水平及其相關性

膽管癌組織及其癌旁正常組織METTL14 mRNA表達量分別為0.075±0.012和0.031±0.006，lnc EIF3J-AS1表達量分別為0.140±0.032和0.064±0.012，癌組織表達量均顯著高于癌旁正常組織，差異均有統計學意義(t值分別為9.85、10.79，P值均<0.05)。膽管癌組織METTL14 mRNA與lnc EIF3J-AS1表達水平呈正相關(r=0.883，P=0.0007，圖1)。

圖1 10例膽管癌組織METTL14 mRNA與lnc EIF3J-AS1表達的相關性

膽管癌組織及其癌旁正常組織METTL14蛋白表達量分別為0.354±0.131和0.187±0.183，癌組織顯著高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(t=13.51，P=0.008，圖2)。

圖2 10例膽管癌組織和癌旁正常組織METTL14蛋白表達水平

二、抑制膽管癌細胞METTL14 mRNA表達對lnc EIF3J-AS1表達的影響

HUCCT1-METTL14組細胞METTL14 mRNA表達水平顯著低于對照組(0.109±0.023比1.000±0.035)，RBE-METTL14組METTL14 mRNA表達水平也顯著低于對照組(0.137±0.011比1.000±0.019 )，差異均有統計學意義(t值分別為8.91、12.51，P值均<0.05)。表明敲減METTL14的HUCCT1和RBE細胞株構建成功。

HUCCT1-METTL14組細胞lnc EIF3J-AS1表達水平顯著低于對照組(0.217±0.020比1.000±0.052)，RBE-METTL14組lnc EIF3J-AS1表達水平也顯著低于對照組(0.149±0.066比1.000±0.045)，差異均有統計學意義(t值分別為8.02、11.23，P值均<0.05)。提示抑制膽管癌細胞METTL14表達可下調lnc EIF3J-AS1的表達。

三、下調lnc EIF3J-AS1表達對膽管癌細胞遷移和侵襲能力的影響

HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組細胞lnc EIF3J-AS1表達水平顯著低于對照組(0.123±0.045比1.000±0.011)，RBE-lnc EIF3J-AS1組lnc EIF3J-AS1表達水平也顯著低于對照組(0.108±0.059比1.000±0.029)，差異均有統計學意義(t值分別為10.22、11.21，P值均<0.05)。表明敲減lnc EIF3J-AS1的HUCCT1和RBE細胞株構建成功。

細胞遷移實驗結果顯示，HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組細胞的遷移和侵襲能力均較對照組顯著下降(每高倍視野穿膜細胞數20.33±0.67比70.67±0.33，5.00±0.58比23.33±0.33)，差異均有統計學意義(t值分別為12.23、11.59，P值均<0.05，圖3)；RBE-lnc EIF3J-AS1組細胞遷移和侵襲能力也均較對照組顯著下降(每高倍視野穿膜細胞數12.00±0.58比25.00±2.52，22.33±0.89比43.67±0.33)，差異均有統計學意義(t值分別為15.12、8.66，P值均<0.05，圖3)。提示下調膽管癌細胞lnc EIF3J-AS1表達可抑制其遷移和侵襲能力。

四、下調lnc EIF3J-AS1表達對膽管癌細胞EGFR-AKT信號通路的影響

HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組EGFR蛋白表達水平和p-AKT/AKT比值均較對照組顯著降低(0.109±0.015比1.000±0.018，0.226±0.036比1.000±0.051，圖4)，差異均有統計學意義(t值分別為8.56、12.77，P值均<0.05)。RBE-lnc EIF3J-AS1組EGFR蛋白表達水平和p-AKT/AKT比值也均較對照組顯著降低(0.118±0.052比1.000±0.069，0.132±0.098比1.000±0.023，圖4)，差異均有統計學意義(t值分別為10.81、12.21，P值均<0.05)。提示下調膽管癌細胞lnc EIF3J-AS1可抑制其EGFR蛋白表達，抑制AKT蛋白的磷酸化。

圖3 HUCCT1對照組、HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組、RBE對照組、RBE-lnc EIF3J-AS1組的遷移(3A～3D)和侵襲(3E～3H)能力(亞甲藍染色 ×400)

圖4 HUCCT1對照組(1)、HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組(2)、RBE對照組(3)、RBE-lnc EIF3J-AS1組(4)膽管癌細胞EGFR、p-AKT、AKT蛋白表達

討 論

m6A修飾是真核RNA中最常見的化學標記，是一種可逆的表觀調控修飾[14]。這種修飾被發現于嵌入RNA轉錄產物共識序列G(G>A)m6AC(U>A>C)中的腺苷，特別是在終止密碼子附近[15]。越來越多的證據表明，RNA中的m6A修飾影響RNA的穩定性和功能，并對大多數生物過程至關重要，包括組織發育、DNA損傷反應、性別決定和腫瘤發生等[16]。m6A甲基轉移酶復合物由METTL3、METTL4、METTL14、WTAP、VIRMA等組成[17]。近期研究表明，甲基化轉移酶METTL4在多種實體惡性腫瘤的發生及進展中發揮著重要作用，然而METTL14在膽管癌的發生和進展中的作用在很大程度上尚不清楚[18]。本研究通過定量PCR以及蛋白免疫印跡實驗證實m6A甲基化酶METTL14在膽管癌腫瘤組織中上調表達，提示METTL14可能在膽管癌的發生和進展中扮演重要的癌基因角色。

lnc RNA在膽管癌的發生發展中扮演關鍵角色，其中lnc EIF3J-AS1首次報道在肝細胞癌腫瘤樣本中顯著上調，并與肝細胞癌的無復發生存密切相關[11]。然而，其對膽管癌細胞惡性行為的潛在生物學作用尚未見報道，且是否受到m6A調控尚未明確。本研究證實lnc EIF3J-AS1在膽管癌腫瘤組織中表達上調，并且與METTL14呈正相關，抑制METTL14表達可下調lnc EIF3J-AS1在膽管癌細胞中的表達水平。進一步實驗證實下調lnc EIF3J-AS1可抑制膽管癌細胞遷移和侵襲能力，并抑制EGFR蛋白表達和Akt蛋白的磷酸化，提示METTL14可能通過上調lnc EIF3J-AS1表達在膽管癌細胞惡性行為中和EGFR-Akt信號通路調控中發揮重要作用。

綜上所述， m6A甲基化酶METTL14介導lnc EIF3J-AS1上調表達可以促進膽管癌細胞的侵襲和遷移能力，但本研究的隊列樣本量少，未來仍需擴大樣本量進一步驗證METTL14與lnc EIF3J-AS1在膽管癌組織和細胞中的表達情況，以及與膽管癌患者預后之間的關系。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突