不同頻率督脈電針促進不完全脊髓損傷大鼠運動功能重建的比較研究

劉瑩瑩，劉偉

不完全性脊髓損傷（incomplete spinal cord injury，iSCI）是脊髓損傷中相對較輕的一類致殘性疾病，多表現為損傷平面以下神經節段感覺區域頑固性觸發性疼痛、自發性痛或痛覺過敏（痛超敏）及運動功能障礙[1,2]。本研究通過觀察低、中、高頻督脈電針對iSCI模型大鼠凝血功能、痛超敏行為學的影響，探討其改善運動功能的可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.1.1 實驗動物及分組 SPF 級雄性Wistar 大鼠50只，7周齡，體質量（230.5±5.5）g，由湖北省實驗動物中心提供[合格證號:SCX K(鄂)2019-0005，福利倫理審批號2017-59]。采用隨機數字表法將大鼠隨機分為假手術組，模型組和低、中、高頻電針組（G1、G2、G3組），各組10只。實驗遵守3R原則，需滿足動物福利。

1.1.2 實驗器材及藥品 主要有：曠場實驗分析系統（上海洛維生物科技有限公司，型號：XR-XZ301）；Noraxon 表面肌電測試儀（美國，上海涵飛醫療器械有限公司，型號：MyoTraceTM 400）；von Frey hair（纖毛機械刺激針，瑞典）；風途FT-SY96A 酶聯檢測儀（山東風途物聯網科技有限公司）；LH202H-四導韓氏穴位神經刺激儀（北京華運安特有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模 3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉大鼠，固定；定位T11棘突，標記T9～T12手術區域，常規備皮、碘伏消毒、鋪無菌巾。以T11棘突為中心區行脊正中皮膚縱行切口，分離淺肌層，暴露T9～T12棘突和椎板，游離T11椎板上下緣并咬去椎板棘突暴露T11節段脊髓，用美國NYU脊髓沖擊損傷儀的擊打（250 g·mm）懸空固定的T11節段脊髓[3]。造模成功標志參考文獻[4,5]：脊髓表面肉眼可見圓形或橢圓形血腫，擊打脊髓時鼠尾出現一過性擺動、后肢痙攣性抽搐后完全松弛。假手術組僅行椎板全切除術。術后縫合皮膚、碘伏消毒。肌注20萬U青霉素，1次/d，共3 d。

1.2.2 治療 術后第7天，用大鼠固定器固定清醒G1、G2、G3 組大鼠，參照《實驗針灸學》，于第7 頸椎與第1胸椎背部正中選“大椎穴”；第2、3 腰椎棘突間背部正中選“命門穴”。用0.3 mm×1 mm毫針，用捻針法緩慢進針，進針深度應達硬膜外。然后接四導韓氏穴位神經刺激儀（大椎接正極，命門接負極），分別予低（2 Hz，2 mA）、中（50 Hz，2 mA）、高（100 Hz，2 mA）頻電針治療，連續波，以雙下肢肌肉出現節律性收縮或下肢輕微抖動為度，30 min/次，1 次/d，共治療2周。假手術組和模型組固定30 min，但不治療。

1.2.3 痛超敏行為學觀察 以治療結束后大鼠出現自發嘶叫及對T11節段以下軀體、后肢和尾部舔咬、搔抓甚至自噬等異常行為學改變為陽性體征，并記錄發生次數。

1.2.4 痛閾檢測 治療結束后采用標準化von Frey hair 痛閾測定方法，測量損傷軀干下端機械性輕觸皮膚、輕壓皮膚、機械輕壓右前爪的機械痛痛閾閾值3項指標。

1.2.5 行為學實驗 ①斜板實驗：治療結束后將大鼠頭朝左橫放于與縱軸垂直的斜板上，然后從0°起、每次增加5°，逐漸增大斜板斜角，期間以大鼠停留在木板上5 sec 不滑落的斜角為有效角度，實驗重復3 次取其平均值。②BBB（Basso Beattie Bresnahan）功能評分：治療結束后將大鼠放入曠場內適應環境1 周，由專門訓練的實驗人員進行評定，BBB分值越高說明運動功能恢復的越好[6]。

1.2.6 表面肌電測試 治療結束后固定清醒大鼠，剃去右后肢鼠毛、酒精脫脂。在股直肌在膝關節與骼前上棘連線中點，股二頭肌在胭窩中點與股骨大轉子連線分別接測試電極，用Noraxon 表面肌電測試儀記錄股二頭?。╞iceps femois，BF）和股直?。╮eoctns femois，RF）的肌電積分值（integoted，IEMG）：BF-TEMG 和RF-TEMG。

1.2.6 凝血功能檢測 在表面肌電測試完成后進行。①斷尾、用玻片接少量血液，用5 號針頭輕輕挑起，以出現絲狀物為凝血時間（clotting time，CT）；以斷尾處不再出血為出血時間（bleeding time，BT）。②凝血酶和內/外源性凝血因子Xa活性檢測：斷尾后準確吸取200 μL，取上述全血中105個全血細胞，分別加入含5 mmol/L CaCL2及1 nmol/L 凝血酶原的緩沖液孵育10 min，加EDTA 終止，然后加入0.8 mmol/L 的S2238，酶標儀波長405 nim，測定凝血酶。再取105個全血細胞加入0.2 nmol/L 凝血酶（IIa）、l nmol/L 因子IXa、5 nmol/L 因子Ⅷ和130 nmol/L 因子X 的緩沖液孵育，10 min 后用7 mmol/L的EDTA終止；加顯色底物，405 nm波長分別測定內/外源性凝血因子Xa[7]。

1.3 統計學處理

采用SPSS 21.0軟件，符合正態分布以及方差齊性的計量資料以（±s）表示，單因素方差分析，兩兩比較采用采用SNK-q檢驗；不滿足方差齊性的數據采用Dunnett C 檢驗和Games-Howell 檢驗；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同頻率督脈電針對iSCI大鼠運動功能的影響

模型組斜角和BBB 評分顯著低于假手術組（P＜0.05）。G1、G2 和G3 組斜角和BBB 評分高于模型組（P＜0.05）；G1 組斜角和BBB 評分高于G2 和G3 組（P＜0.05），G2 和G3 組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠BBB評分和斜板實驗結果比較（±s）

表1 各組大鼠BBB評分和斜板實驗結果比較（±s）

注：與假手術組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與G3組比較，③P＜0.05；與G2組比較，④P＜0.05

組別假手術組模型組G3組G2組G1組只數10 10 10 10 10 BBB/分18.90±1.19 7.68±0.54①11.78±1.47②12.09±0.92②14.75±1.42②③④斜角/度66.04±5.21 28.08±1.47①43.55±2.73②41.78±1.98②52.05±4.64②③④

2.2 不同頻率督脈電針對iSCI大鼠痛超敏行為學異常改變的影響

模型組大鼠出現搔抓、舔咬損傷平面以下部位并對尾部及后肢出現自噬及自發嘶叫現象較假手術組增多（P＜0.05）。G1、G2和G3組大鼠的上述現象則較模型組明顯降低（P＜0.05）；G1 組大鼠的上述現象低于G2 和G3 組（P＜0.05），但G2 和G3 組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠痛超敏行為學異常改變比較（次, ±s）

表2 各組大鼠痛超敏行為學異常改變比較（次, ±s）

注：與假手術組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與G3組比較，③P＜0.05；與G2組比較，④P＜0.05

組別假手術組模型組G3組G2組G1組只數10 10 10 10 10自發嘶叫0.54±0.01 12.01±1.17①9.01±0.90②8.73±0.85②6.46±0.22②③④搔抓4.59±0.24 19.60±1.53①13.67±1.36②14.91±0.95②10.80±1.59②③④組別假手術組模型組G3組G2組G1組舔咬1.50±0.04 15.69±1.65①11.81±1.52②10.61±1.93②8.90±0.92②③④自噬0.00±0.00 9.60±1.24①8.91±1.01②8.79±0.58②6.87±0.71②③④

2.3 不同頻率督脈電針對iSCI大鼠機械痛閾值的影響

模型組大鼠機械痛閾值明顯降低，其對損傷軀干下端機械性輕觸皮膚、輕壓皮膚、機械輕壓右前爪的機械痛痛閾閾值均較假手術組顯著降低（P＜0.05）。G1、G2 和G3 組大鼠的上述閾值均高于模型組（P＜0.05）；G1組高于G2和G3組（P＜0.05），但G2和G3組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠機械痛閾值比較（g, ±s）

表3 各組大鼠機械痛閾值比較（g, ±s）

注：與假手術組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與G3組比較，③P＜0.05；與G2組比較，④P＜0.05

組別假手術組模型組G3組G2組G1組只數10 10 10 10 10機械輕壓右前爪65.90±4.89 17.56±1.87①33.78±1.80②34.65±2.10②40.76±4.29②③④組別假手術組模型組G3組G2組G1組輕觸皮膚72.50±4.09 15.69±1.38①24.78±2.04②25.69±1.97②31.82±2.37②③④輕壓皮膚65.32±5.27 8.69±1.45①29.04±3.07②28.64±2.95②34.81±2.74②③④

2.4 不同頻率督脈電針對iSCI 大鼠BF-TEMG 和RF-TEM的影響

模型組BF-TEMG 和RF-TEM 較假手術組明顯降低（P＜0.05）。G1、G2 和G3 組大鼠的BF-TEMG 和RF-TEM高于模型組（P＜0.05）；G1組高于G2和G3組（P＜0.05），但G2 和G3 組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 各組大鼠BF-TEMG和RF-TEM檢測結果比較（μv, ±s）

表4 各組大鼠BF-TEMG和RF-TEM檢測結果比較（μv, ±s）

注：與假手術組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與G3組比較，③P＜0.05；與G2組比較，④P＜0.05

組別假手術組模型組G3組G2組G1組只數10 10 10 10 10 BF-TEMG 120.86±7.39 66.18±3.70①94.54±5.61②96.02±4.98②113.98±7.43②③④RF-TEM 176.23±11.24 75.03±5.57①121.57±9.36②123.91±7.45②147.70±8.56②③④

2.5 不同頻率督脈電針對iSCI大鼠凝血功能的影響

與假手術組相比，模型組內/外源性凝血因子Xa和凝血酶生成明顯增多，CT和BT縮短（P＜0.05）。與模型組相比，G1、G2 和G3 組大鼠內/外源性凝血因子Xa和凝血酶生成降低，CT和BT延長（P＜0.05）；G1組改變幅度大于G2 和G3 組（P＜0.05），但G2 和G3 組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表5。

3 討論

SCI是一種嚴重的中樞神經系統疾病，致殘率高[8]。中醫學將其歸屬于“痿證”范疇。督脈屬奇經八脈之首，匯集全身陽氣。脊髓與督脈的功能相似，iSCI 與“痿證”相符，也可視之為“督脈損傷”[9]。比較不同刺激頻率督脈電針治療iSCI有一定的臨床指導意義。

表5 各組iSCI大鼠凝血功能改變比較（±s）

表5 各組iSCI大鼠凝血功能改變比較（±s）

注：與假手術組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與G3比較，③P＜0.05；與G2組比較，④P＜0.05

組別假手術組模型組G3組G2組G1組只數10 10 10 10 10 CT/s 78.84±5.39 67.64±4.26①70.31±5.07②70.75±4.27②74.50±3.44②③④BT/s 816.75±32.75 633.45±29.07①707.84±30.02②710.19±33.45②780.71±27.86②③④凝血酶/U 9.41±0.96 17.53±2.46①14.73±1.08②13.92±1.67②10.37±0.95②③④內源性凝血因子Xa/(pg/mL)49.81±2.09 60.59±4.13①55.07±1.22②57.78±2.74②53.23±2.80②③④外源性凝血因子Xa/(pg/mL）42.09±2.76 54.38±3.80①48.79±1.30②47.48±2.83②45.15±1.67②③④

本實驗模型組大鼠出現典型的“督脈損傷”，如痛超敏行為學異常、痛閾閾值降低、凝血功能異?？哼M等現象。大鼠肌力和肢體協調性下降、運動功能損傷嚴重。經治療，G1、G2、G3組大鼠凝血功能恢復，痛超敏行為學、BF-TEMG、RF-TEM 及痛閾閾值均有不同程度改善，大鼠運動功能也明顯恢復。提示低、中、高頻電針均可改善微環境并促進iSCI 大鼠運動功能恢復，但低頻督脈電針（G1組）的作用優于中、高頻。研究表明，督脈電針可改善腦部血液循環，促進腦脊液流動和SCI 部位水腫消退，使運功和感覺得到一定程度的恢復[10,11]。另外，iSCI可導致下肢骨骼肌萎縮及微循環障礙，表現為肌力下降，肢體協調性降低，如斜板傾斜度及BF-TEMG、RF-TEM 降低[12,13]；而后者可能形成嚴重的下肢靜脈血栓，也是影響運動功能恢復的重要因素[14]。低頻督脈電針可能是通過改善凝血功能，使損傷部位血液流動性增強，減少因凝血亢進而引起的氣血淤堵現象，化生氣血促進損傷部位血液循環和神經功能的恢復。也可通過提高大鼠痛閾而減輕iSCI痛超敏行為學改變，這有利于損傷部位神經水腫及炎癥消除。電針儀輸出電流可喚醒受損脊髓神經元的覺醒，恢復其興奮和傳導，這有利于肢體運動功能的恢復，“既可培補真陽，又可疏通臟腑經氣，陽氣上下貫通”[15]。

綜上所述，督脈電針改善iSCI 大鼠運動功能的可能機制是：改善亢進凝血功能-化生氣血促進損傷部位血液循環和神經功能的恢復-提高痛閾-減輕iSCI痛超敏-肌力增強-逐步恢復運動功能。在這一作用過程中，低頻督脈電針疏通“督脈損傷”引起的淤阻、改善微環境及增強肢體協調性以促進運動功能重建方面作用優于中、高頻督脈電針。