硫酸鋅對缺氧/復氧損傷H9c2心肌細胞自噬及氧化應激的影響

吳小燕，吳曾繁，陳 磊

經皮冠狀動脈介入術是治療缺血性心臟病的有效方法，然而缺血心肌復氧后的缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷常常會減弱治療效果甚至加重心肌損傷[1]。誘發I/R損傷的機制較為復雜，心肌細胞凋亡是其中的重要病理機制[2]，自噬是機體的一種防御和應激調控反應，適當的自噬可以修復受損的細胞器，維持細胞內穩態，I/R損傷中適當激活的自噬可以起到拮抗心肌細胞凋亡的作用[3]。鋅是重要的細胞內信號傳導分子[4]，研究發現，補充外源性鋅可減輕心肌I/R損傷，但其機制尚未明確[5]。本研究使用H9c2心肌細胞進行缺氧/復氧(hypoxia and reoxygenation，H/R)實驗，模擬心肌I/R損傷，探討硫酸鋅對H/R心肌細胞自噬的影響，以及心肌H/R損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 心肌H9c2細胞株購自上海子實生物科技有限公司，硫酸鋅購自美國Sigma 公司，無糖DMEM培養基、低糖DMEM培養基購于美國 Gibco 公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購于四季青公司，Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物科技有限公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，自噬體膜型(LC3Ⅱ)抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)內參抗體購自美國Cell Signaling公司，辣根過氧化物酶標記的二抗購于上?？党缮锕こ逃邢薰?，RIPA蛋白裂解液、0.25%胰蛋白酶購自北京碧云天生物科技有限公司，二氧化碳(CO2)細胞培養箱購自美國Thermo Scientific公司，流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 實驗分組和H/R模型構建 實驗分為對照組、H/R組、低劑量硫酸鋅組(LD-Zn組)和高劑量硫酸鋅組(HD-Zn組)。對照組H9c2細胞培養于10% FBS的低糖DMEM培養基中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中，80%細胞融合時，0.25%胰蛋白酶消化細胞傳代。H/R組H9c2細胞培養于無血清、無糖DMEM培養基中，置于37 ℃、1%O2細胞培養箱中缺氧培養24 h。LD-Zn組H9c2細胞缺氧培養24 h后，加入10 μmol/L硫酸鋅后，換10% FBS的低糖DMEM培養基，置于37 ℃、21%O2細胞培養箱中進行復氧處理4 h，進行后續實驗。HD-Zn組H9c2細胞缺氧培養24 h后，加入20 μmol/L硫酸鋅后，換10% FBS的低糖DMEM培養基，置于37 ℃、21%O2細胞培養箱中進行復氧處理4 h。

1.3 細胞凋亡檢測 0.25%胰蛋白酶消化對照組、H/R組、LD-Zn組和HD-Zn組H9c2細胞，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細胞2次，按照Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，加入Annexin V(1∶20)室溫孵育3 min，再加入20 μg/mL PI室溫孵育15 min，進行流式細胞儀測定，儀器自帶BD Cell QuestTMPro軟件收集凋亡細胞(Annexin V陽性或Annexin V和PI雙陽性的細胞)，計算凋亡細胞比例。

1.4 SOD和MDA表達的檢測 收集對照組、H/R組、LD-Zn組和HD-Zn組H9c2細胞，使用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD，硫代巴比妥酸比色法檢測 MDA，嚴格按照試劑盒說明書操作，加入相關試劑裂解細胞完成檢測。

1.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測心肌H9c2細胞蛋白表達 收集對照組、H/R組、LD-Zn組和HD-Zn組H9c2細胞，加入RIPA蛋白裂解液，95 ℃水浴裂解液20 min后，將蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，按照抗體說明書加入LC3Ⅱ抗體(1∶1 000)或者GAPDH內參抗體(1∶5 000)4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，X-ray曝光顯影，凝膠成像系統采集圖像，Image J軟件對照內參分析LC3Ⅱ蛋白條帶的灰度值。

2 結 果

2.1 各組H9c2心肌細胞凋亡率比較 對照組、H/R組、LD-Zn組和HD-Zn組H9c2心肌細胞凋亡率比較差異有統計學意義(F=18.416，P<0.01)。其中H/R組H9c2心肌細胞凋亡率高于對照組(P<0.01)，LD-Zn組和HD-Zn組H9c2細胞凋亡率明顯低于H/R組(P<0.01)，HD-Zn組H9c2細胞凋亡率明顯低于LD-Zn組(P<0.01)。詳見圖1、表1。

圖1 流式細胞儀檢測各組H9c2心肌細胞凋亡率

表1 各組H9c2心肌細胞凋亡率比較 單位：%

2.2 各組H/R心肌細胞MDA和SOD表達比較 對照組、H/R組、LD-Zn組、HD-Zn組H9c2心肌細胞MDA和SOD水平比較差異有統計學意義(P<0.01)。其中H/R組MDA水平明顯高于對照組(P<0.01)，LD-Zn組和HD-Zn組MDA水平明顯低于H/R組(P<0.01)，HD-Zn組MDA水平明顯低于LD-Zn組(P<0.01)；H/R組SOD水平明顯低于對照組(P<0.01)，LD-Zn組和HD-Zn組SOD水平明顯高于H/R組(P<0.01)，HD-Zn組SOD水平明顯高于LD-Zn組(P<0.01)。詳見表2。

表2 4組MDA、SOD水平比較

2.3 各組H/R心肌細胞LC3Ⅱ蛋白表達比較 對照組、H/R組、LD-Zn組和HD-Zn組H9c2心肌細胞自噬蛋白LC3Ⅱ表達比較差異有統計學意義(F=13.542，P<0.01)。LD-Zn組和HD-Zn組LC3Ⅱ蛋白相對灰度值明顯高于H/R組(P<0.01)，HD-Zn組LC3Ⅱ蛋白相對灰度值明顯高于LD-Zn組(P<0.01)。詳見圖2及表3。

圖2 Western Blot檢測LC3Ⅱ蛋白表達

表3 各組LC3Ⅱ蛋白表達比較

3 討 論

近年來，心肌梗死發病率日益提高，隨著經皮冠狀動脈擴張、支架植入術的廣泛使用，極大地提高了心肌梗死的救治率，但缺血心肌再灌注后心肌細胞的H/R損傷依然給臨床工作帶來了新的問題與挑戰[6]。研究已證實鋅離子在心力衰竭、血栓形成中對心肌細胞及內皮細胞具有保護作用[7]，周薔等[8]研究發現，硫酸鋅有利于心肌梗死大鼠心功能的恢復；付海榮[9]研究發現硫酸鋅可以抑制大鼠急性梗死心肌細胞的凋亡。本研究結果顯示，LD-Zn組和HD-Zn組細胞凋亡率明顯低于H/R組，說明硫酸鋅可以抑制H/R損傷導致的心肌細胞凋亡。H/R損傷時氧化應激激活，活性氧(ROS)大量積累，誘導心肌細胞凋亡[10]。SOD是一種抗氧化酶，MDA是氧化應激反應的代謝產物，MDA和SOD是監控氧化應激的常用指標。本研究結果顯示，LD-Zn組和HD-Zn組MDA明顯低于H/R組，SOD明顯高于H/R組，說明硫酸鋅可以抑制H/R損傷激發的氧化應激反應。硫酸鋅抗H/R損傷導致的心肌細胞凋亡可能與抑制氧化應激反應相關。

心肌細胞對能量的需求量非常大，故而心肌細胞含有大量線粒體保證其能量供應，氧化應激時，線粒體損傷更容易損傷心肌細胞，自噬可以增強清除受損的線粒體和內質網，給細胞提供能量，保持細胞穩態[11]，通過調控自噬可以減輕氧化應激導致的大鼠心肌缺血再灌注損傷[12-13]。LC3Ⅱ是一個自噬標志蛋白，在自噬增強時LC3Ⅱ表達增多[14]，本研究顯示，LD-Zn組和HD-Zn組LC3Ⅱ蛋白相對灰度值明顯高于H/R組，說明硫酸鋅可明顯增加H/R損傷心肌細胞的自噬反應。

綜上所述，硫酸鋅可以增強H/R損傷心肌細胞的自噬，抑制氧化應激損傷和心肌細胞凋亡。