芳香環修飾的5-苯基-2,4-戊二烯酰哌啶的合成和活性研究*

余麗麗，秦 蘭,2，王成斌，田利娜，秦 蓓,2

（1.西安醫學院 藥學院，藥物研究所，陜西 西安710021；2.成都醫學院 藥學院，四川 成都610500）

天然產物的結構研究和基于天然產物的結構修飾，是發現具有生物活性的化合物的重要研究基礎[1-4]。生物堿是一類含有氮的天然有機化合物，具有類似于堿的性質。生物結構種類繁瑣，按照其基本結構進行分類可分為約60類[5]。哌啶類生物堿就是其中的一類，該類生物堿被研究者們廣泛研究，并證實其中多數具有一定的生物學活性[6-8]。此外，文獻調研發現，一些通過共軛烴基連接芳香環、哌啶環或者脂肪胺的生物堿或者生物堿衍生物具有良好的生物學活性。例如，Min Han等[9]合成了芳香環修飾的肉桂酰胺類化合物，并且驗證了其具有良好的抗抑郁活性。Natarajan等[10]合成了通過長共軛結構連接芳香環和哌啶環的生物堿衍生物，并驗證了其良好的NF-kB的抑制作用、細胞遷移抑制作用。朱美玲[11]合成了芳香環修飾的阿魏酰哌啶類化合物，并證實該類化合物具有良好的抗氧化活性。

據此，本研究合成了通過長共軛酰胺鍵連接芳香環和哌啶環的4種生物堿類似物，并對其結構進行了表征。同時初步探討了化合物4d對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

1 實驗部分

1.1 原料與試劑

二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯（EA）、四氫呋喃（THF），均為分析純，天津市恒興化學試劑制劑有限公司；二甲基亞砜（DMSO）（AR天津市富宇精細化工有限公司）；巴豆酸（98%）、哌啶鹽酸鹽（98%）、草酰氯（98%）、2，4-二甲氧基苯甲醛（98%）、3，4-二甲氧基苯甲醛（98%）、4-甲氧基苯甲醛（98%）、對氯苯甲醛（98%），薩恩化學技術（上海）有限公司；對硝基苯基-α-D-葡萄糖苷（PNPG）（98%），百靈威；α-葡萄糖苷酶（500000U·mL-1），上海金穗；Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O均為分析純，西隴科學；Na2CO3（AR天津紅巖試劑）。

AVANCEⅢ型400MHz核磁共振波譜儀（德國-瑞士Bruker公司）；1260-6460A型三重四級桿液-質聯用儀（美國安捷倫公司）；JHX-4B型顯微熔點測定儀（上海佳航儀器儀表有限公司）；ZF-7N型智能暗箱式三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；HJ-2A型磁力加熱攪拌器（常州國華電器有限公司）；UV-2102 PCS型紫外可見分光光度計（尤尼柯（上海）儀器有限公司）；Multiskan FC型自動全波長酶標儀（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；Sybyl軟件（2.1.1美國Tripos公司）。

1.2 合成方法

圖1 芳香環修飾的5-苯基-2,4-戊二烯酰哌啶的合成Fig.1 Synthesis of 5-phenyl-2,4-pentadienylpiperidine modified by aromatic ring

1.2.1 巴豆酰氯（2）的制備 取巴豆酸（1.13g，13.17mmol）于100mL圓底燒瓶中，加入5mL無水DCM，超聲分散，加入草酰氯1.1mL（31.7mmol），常溫攪拌。反應完成后，濃縮，即得巴豆酰氯（2）。

1.2.2 巴豆酰哌啶（3）的合成 向100mL圓底燒瓶加入哌啶鹽酸鹽（1.69g，13.86mmol）、8mL四氫呋喃（THF）和10mL的1M NaOH溶液，0℃下。將上述制得的巴豆酰氯溶于3mL無水THF溶液，并將其緩慢滴加至反應液中，0℃下反應2h后，用乙酸乙酯萃?。?0mL×3），合并有機層，分別用1M的HCl溶液、1M NaOH溶液和飽和NaCl洗滌1次，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾，得淡黃色液體1.46g，產率為73%。

1.2.3 芳香環修飾的5-苯基-2,4-戊二烯酰哌啶（4a～4d）的合成 取2,4-二甲氧基苯甲醛（1.30g，7.8mmol）于100mL圓底燒瓶中，加入5mL DMSO，超聲分散溶解，加入巴豆酰哌啶（1.19g，7.8mmol），攪拌同時加入1mL 50% KOH溶液，室溫反應1h。用20mL H3PO4（30%）淬滅反應，加入20mL DCM進行萃取，水洗3次后用無水Na2SO4干燥，濃縮得到黃色固體產物（4a）1.41g，產率為60.0%。

用對氯苯甲醛（1.10g，7.8mmol）、4-甲氧基苯甲醛（7.8mmol，1.06g）、2,3-二甲氧基苯甲醛用量為（1.30g，7.8mmol）為原料分別合成4b、4c、4d，產率分別為63.0%、54.2%、58.1%。

1.3 分子對接

利用Sybyl 2.1.1中的Surflex-Dock模塊對化合物和α-葡萄糖苷酶進行分子對接。

小分子準備 在Sybyl中建立化合物結構數據庫，并對每個小分子進行加氫、加電荷（Gasteiger-Hückel），并選擇Tripos力場進行能量優化（優化次數10000，能量收斂標準0.005kcal/mol·A），建立相關表單；

大分子準備和對接 從蛋白質數據庫中（http：//www.rcsb.org/pdb）下載α-葡萄糖苷酶晶體結構（1UOK），并采用Sybyl 2.1.1軟件對蛋白結構進行準備。對接時選取蛋白結構中的文獻報道的活性口袋為活性中心[12]，每個化合物生成20個對接構象，并計算經驗參數。

1.4 α-葡萄糖苷酶抑制劑的活性測定

參照文獻[13]方法，按表1依次加入0.1mol·L-1磷酸鹽緩沖液（PBS，pH值6.8）、抑制劑溶液和PNPG底物，混合均勻，于37℃孵育15min，取出加入37℃預熱的酶溶液；混勻，于37℃水浴反應30min，加入Na2CO3溶液終止反應，實驗設3個平行組。在405nm測定吸光度并按照下式計算抑制率：

表1 反應物添加量（μL）Tab.1 Adding amount of reactants

2 結果與討論

2.1 巴豆酰哌啶的合成和表征

實驗以巴豆酸為原料，先通過與草酰氯酰氯化制得巴豆酰氯（圖1），再與哌啶鹽酸鹽在堿性環境下酰胺化合成巴豆酰哌啶。整個過程中應使用無水溶劑，保證實驗儀器干燥，且由于酰氯的活潑性較高，中間產物巴豆酰氯需現制現用。

1H NMR（400MHz,Chloroform-d）δ6.84（dtd,J=14.7,7.7,7.3,6.3Hz,1H）,6.28（dq,J=15.0,1.5Hz,1H）,3.55（s,4H）,1.88（dt,J=6.8,1.3Hz,4H）,1.70～1.63（m,2H）,1.58（ddd,J=9.5,4.7,2.7Hz,4H）。

2.2 芳香環修飾的5-苯基-2,4-戊二烯酰哌啶（4a-4d）的合成和表征

實驗通過巴豆酰哌啶與3,4-二甲氧基苯甲醛、對氯苯甲醛、4-甲氧基苯甲醛、2,3-二甲基苯甲醛在堿性環境的羥醛縮合-消除反應合成芳香環修飾的5-苯基-2,4-戊二烯酰哌啶（4a～4d）。實驗通過核磁共振氫譜和質譜對化合物的結構進行了表征。

4a：ESI-MS：M/Z=301.09；1H NMR（400MHz，CDCl3）:δ7.52～7.39（m,2H）,7.12（d,J=15.6Hz,1H）,6.89（dd,J=15.7,11.1Hz,1H）,6.52～6.45（m,2H）,6.42（d,J=14.6Hz,1H）,3.89～3.84（m,6H）,3.60（s,4H）,1.68（d,J=5.3Hz,2H）,1.61（d,J=5.7Hz,3H）。

4b：ESI-MS：M/Z=274.99；1H NMR（400MHz,CDCl3）:δ7.48～7.30（m,5H）,6.97～6.76（m,2H）,6.52（d,J=14.7Hz,1H）,3.61（s,4H）,1.74～1.66（m,2H）,1.62（ddt,J=11.0,7.7,4.0Hz,5H）。

4c：ESI-MS：M/Z=271.35；1H NMR（400MHz,CDCl3）:δ7.41（d,J=8.8Hz,3H）,6.90（dd,J=9.2,3.0Hz,2H）,6.81（d,J=8.2Hz,2H）,6.45（d,J=14.6Hz,1H）,3.85（d,J=0.9Hz,3H）,3.61（s,4H）,1.69（d,J=4.9Hz,3H）,1.61（dd,J=7.0,4.0Hz,5H）。

4d：ESI-MS：M/Z=302.1；1H NMR（400MHz,CDCl3）:δ7.47（ddt,J=14.4,10.0,4.8Hz,1H）,7.09～6.95（m,2H）,6.94～6.75（m,3H）,6.48（d,J=14.7Hz,1H）,3.98～3.88（m,6H）,3.61（s,4H）,1.68（s,3H）,1.65～1.59（m,5H）。

2.3 計算機模擬篩選

表2 化合物與α-葡萄糖苷酶的對接結果Tab.2 Docking results of compounds withα-glucosidase

實驗通過SYBYL軟件中的Surflex-Dock對化合物與α-葡萄糖苷酶進行對接。對接打分分別有Total Score、D Score、PMF Score、G Score、Chem－Score、C Score[12]。起關鍵作用的是Total Score和C Score，其中Total Score標志了受體和配體之間的親和力，打分越高，親和力越大[12]；C Score是其他5種打分的綜合考量，其分值上線為5，該值越高表示配體和受體的對接構象越接近于實際分子的構象[12]，通常認為C Score大于等于4才有意義。因此，在滿足C Score大于等于4前提下，Total Score越大越好。表2為對接結果的經驗打分，由表2可見，化合物4d的Total Score值最高。

本文對文獻[12]報道的關鍵殘基5A內形成的活性口袋與化合物進行了對接，圖2為化合物4d與α-葡萄糖苷酶的對接圖。根據文獻報道，α-葡萄糖苷酶的活性口袋為深橢圓形，其邊緣及內部存在一些極性區域[14]，此外，文獻報道該口袋為疏水性口袋[12,14]，因此，本實驗的化合物的結構中設計了長的疏水鏈段和疏水性的取代基，以期望提高化合物與α-葡萄糖苷酶的結合力，從而提高化合物的潛在活性。

圖2 化合物4d與α-葡萄糖苷酶的對接圖Fig.2 Docking diagram of compound 4d withα-glucosidase

由圖2可知，化合物4d能夠很好地深入到α-葡萄糖苷酶的活性口袋中，并與活性口袋中的部分氨基酸殘基形成氫鍵作用。其中，化合物4d結構上酰胺鍵的氧原子與氨基酸殘基ARG415形成氫鍵，苯環上3位上的甲氧基中的氧原子可與氨基酸殘基TRP294形成氫鍵。由此可見，化合物4d能結合于α-葡萄糖苷酶的活性口袋，且氫鍵和疏水作用是化合物與α-葡萄糖苷酶主要作用方式。

2.4 化合物4d對α-葡萄糖苷酶的抑制和酶動力學研究

為了驗證化合物4d的活性，本實驗對該化合物的α-葡萄糖苷酶的抑制作用進行了初步驗證，結果見圖3。

圖3 4d對α-葡萄糖苷酶的抑制（±SD）Fig.3 Inhibition ofα-glucosidase by 4d

由圖3可見，化合物4d對α-葡萄糖苷酶的抑制作用比較顯著，在一定濃度范圍內（1～5mmol·L-1），隨著化合物4d的濃度水平的提高，抑制率顯著提高。其中在濃度為5mmol·L-1時，化合物4d對α-葡萄糖苷酶的抑制率可達38.2%。

3 結論

實驗通過酰氯化反應、酰胺化反應、羥醛縮合反應，合成了4種苯環修飾的胡椒堿衍生物，并對其結構進行了表征，該研究為芳香環修飾的5-苯基-2,4-戊二烯酰哌啶類化合物的系列化合成奠定了合成基礎，為該類化合物后續的活性研究提供了化合物。計算機模擬分子對接實驗篩選出化合物4d與α-葡萄糖苷酶具有相互作用，化合物與活性點位之間的作用主要依靠于氧原子與氨基酸殘基之間的氫鍵以及分子與活性口袋之間的疏水作用。實驗對化合物4d的α-葡萄糖苷酶抑制活性進行了初步探討，驗證了其具有抑制α-葡萄糖苷酶的作用。