陳忠新,茍鑫宇,牟景龍,解 穎,李 強
(1.黑龍江中醫藥大學,黑龍江 哈爾濱150040;2.哈爾濱維科生物技術開發公司,黑龍江 哈爾濱150069)
清心蓮子飲是國家發布的第一批《經典名方目錄》方藥之一,來源于《太平惠民和劑局方》,具有清心火,益氣陰,交心腎、清熱利濕、益氣扶正、生津、收斂浮陽之功效[1]。主治:小便白濁,便赤如血,口舌干燥漸成消渴,男子五淋,婦人帶下赤白及病后氣不收斂,五心煩熱?,F今臨床仍廣泛應用,多用于治療腎臟疾病及尿路感染等[2-4]。
該方由九味中藥組成,其中車前子清熱利濕為方中臣藥,其有效成分環烯醚萜類京尼平苷酸具有抗炎作用[5,6]。本研究以京尼平苷酸為指標性成分,采用HPLC測定其含量,為清心蓮子飲的后續研究及應用奠定了基礎。
ThermoU3000型高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司);AB204-N型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);KQ-500D型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司);GLZY-0.5B型真空冷凍干燥機(上海浦東冷凍干燥設備有限公司)。
購自中檢所的京尼平苷酸對照品(批號:111828-201403);色譜甲醇采購于迪馬科技有限公司;甲醇、HAc等分析純試劑均購自天津天大化學試劑有限公司;方中九味藥材均為道地藥材,其中車前子購自河北省滄州市。
選用Elite HPLC C18(4.6×25mm,5μm)色譜柱,以甲醇-0.5% HAc(體積比5→32∶95→68)為流動相進行梯度洗脫,將檢測波長設定為254nm,柱溫采用30℃,流速設置為1.0mL·min-1。
按《太平惠民和劑局方》記載,稱取蓮子30g、黃芩20g、車前子20g、茯苓30g、麥冬20g、地骨皮20g、炙黃芪30g、人參30g、炙甘草20g?;旌头鬯檫^篩并混勻,稱取粗粉12g,加麥冬3g,300mL水煎煮兩次,每次1h,得240mL標準煎液。制備成凍干粉,備用。精取凍干粉0.22g,用20mL 60%甲醇超聲溶解20min,濾過,蒸干,甲醇定容至10mL容量瓶中,即得。
精密稱取京尼平苷酸對照品4.5mg,甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中,制成濃度為0.09mg·mL-1的標準品溶液,即得。
稱取處方中除車前子外的其他八味藥材,按2.2項下方法制備成陰性對照樣品溶液。
按2.1項下色譜條件,取對照品溶液、供試品溶液以及陰性對照液,進行色譜測定,結果在246nm條件下,對照品溶液及供試品溶液在相同的保留時間呈現一致的特征峰,而陰性樣品溶液無對應色譜峰,因此說明,陰性對照樣品對京尼平苷酸的測定無干擾。色譜圖見圖1。
圖1 對照品、供試品及陰性對照色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard,test sample and negative control
精密吸取2.3項下京尼平苷酸標準品溶液各2、4、6、8、10μL,注入高效液相色譜儀,按2.1項下色譜條件進行測定。以含量為X軸,峰面積比值為Y軸進行線性回歸,得標準曲線回歸方程為Y=11.185X+0.065,R2=0.9999。結果表明京尼平苷酸含量在0.18~0.90μg之間線性關系良好。
取2.2項下供試品溶液,按2.1項下色譜條件,連續重復進樣測定6次,每次10μL,計算京尼平苷酸峰面積的RSD值為0.76%(RSD<3%),表明儀器精密度良好。
分別量取2.2項下各凍干粉0.22g按后續方法進行處理,制成6份供試品溶液,各進樣10μL,測得京尼平苷酸平均值為4.8025mg·劑-1,RSD值為2.65%(RSD<3%),表明方法重復性良好。
取配制好的同一供試品溶液,在0、2、4、6、8、10、12h各進樣10μL,測得京尼平苷酸峰面積RSD值為2.59%(RSD<3%),表明樣品在配制完成后的12h內基本穩定。
精密稱取2.2項下制備的6份清心蓮子飲凍干粉各0.11g,分別加入0.14mg·mL-1的京尼平苷酸標準品溶液各1mL,制備成供試品溶液,測定條件參照2.1項,每次進樣量同上,計算回收率,結果符合加樣回收率要求,見表1。
分別取不同批次的清心蓮子飲凍干粉各0.22g,精密稱定,按2.2項下方法制備供試品溶液。分別取10μL注入高效液相色譜儀中,記錄峰面積,計算京尼平苷酸含量。3批樣品京尼平苷酸含量分別為4.8244、4.8770和5.0073mg·劑-1,考慮到實驗誤差的存在,各基準物質含量略有差異,在合理的波動范圍之間。
清心蓮子飲化學成分復雜,車前子為方中臣藥,京尼平苷酸為車前子的主要有效成分。本實驗建立了一種高效液相色譜方法,并對實驗方法進行了方法學考察,并用該方法對3個平行批次樣品中該指標性成分的含量進行了測定,結果表明,本實驗方法比較成熟,科學合理,穩定可靠,重復性好,在線性范圍內具有良好的靈敏度和加樣回收率,為清心蓮子飲有效成分的含量測定、質量控制以及臨床的合理應用提供了實驗依據和理論支持。