新疆栽培荒漠肉蓯蓉醇提物的免疫調節作用研究

楊秀梅 楊雨 王丹陽 張愛蓮

新疆大學生命科學與技術學院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046

0 引言

當前，各種傳染病如新型冠狀病毒肺炎、流感、艾滋病、乙型肝炎等仍嚴重危害著人類健康。在這些疾病的預防和治療中，中藥發揮著重要作用。已知具有免疫調節作用的中藥達200多種，其中補益類中藥如人參、肉蓯蓉、枸杞、黃芪、何首烏、五味子、肉桂等可綜合性提高機體免疫力，與其他中藥相比，補益類中藥的有效成分具有高活性的免疫調節作用[1-3]。近年來，隨著傳染病、癌癥、代謝性疾病等不斷增加，對疾病的治療不僅僅是減輕臨床癥狀，更多的是關注安全有效的治療策略。因此，從補益類中藥中篩選安全、有效的免疫調節活性成分用于疾病防治具有積極意義。

新疆荒漠肉蓯蓉（Cistanche deserticola.Y.C.Ma）為列當科肉蓯蓉屬植物，藥理研究結果表明，苯乙醇苷類化合物和糖類是其主要活性成分，苯乙醇苷類化合物主要表現為抗氧化、神經保護和抗炎作用等，而多糖具有抗氧化、免疫調節和抗衰老活性[4-6]。鑒于肉蓯蓉的滋補作用，作為食品來源的傳統補益類中藥消費量大。新疆是肉蓯蓉的主產區，因過度采挖導致有限的野生肉蓯蓉資源瀕臨枯竭，難以滿足需求；通過多年的人工栽培技術研究，新疆成功種植了大面積的荒漠肉蓯蓉，且主要成分與野生肉蓯蓉一致[7-9]。研究者們對肉蓯蓉的化學成分、藥理作用、食品保健等諸多方面做了大量深入細致的研究，建立了苯乙醇苷和多糖等多種活性成分的定量分析和分離方法、指紋圖譜及生藥的質量標準，但對栽培肉蓯蓉醇提物對特異性免疫反應的作用特點尚不清楚。

為此，基于肉蓯蓉的藥理活性，本研究選用新疆栽培荒漠肉蓯蓉醇提物（ethanol extracts of cultivated Cistanche deserticola，EECCD）為研究材料，通過小鼠體內實驗研究其量效關系以及對體液免疫反應、細胞免疫反應和細胞因子等的影響，觀察EECCD對特異性免疫反應的免疫調節特點，為從EECCD中篩選免疫調節活性成分用于人類和動物疾病防治提供依據，也為更好地開發利用新疆栽培荒漠肉蓯蓉提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

EECCD（其中苯乙醇苷類化合物的質量分數為17.12%，筆者所在實驗室制備[10]），辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG、IgG1和IgG2a抗體（美國Southern Biotech公司），卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）、刀豆蛋白A（concanavalin A,ConA）、噻唑藍（美國Sigma公司），鋁佐劑（A lum adjuvant,Al um）（美國Thermo公司），莫能霉素、Fc封閉抗體、別藻藍蛋白（allophycocyanin，APC）標記的CD4抗體（APC-CD4）、藻紅蛋白（phycocyanin，PE）標記的白細胞介素-4（interleukin-4,IL-4）抗體（PE-IL-4）、PE標記的γ-干擾素（interferonγ,IFN-γ）抗體（PE-IFN-γ）、PE標記的CD11c抗體（PECD11c）、異硫氰酸熒光素（flourescein isothiocyanate，FITC）標記的CD40抗體（FITC-CD40）、APC標記的CD80抗體（APC-CD80）、APC-CD86、FITC標記的主要組織相容性復合體Ⅱ類（major histocompatibility complex classⅡ，MHCⅡ）抗體（FITC-MHCⅡ）、Cytofix/Cytoperm緩沖液、Perm/Wash緩沖液（美國BD公司），CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞（regulatory T cell,Treg）檢測試劑盒（美國eBioscience公司）。

健康清潔級6～8周齡ICR雌性小鼠42只，體質量范圍18～22 g，來自新疆醫科大學動物實驗中心，許可證號SCXK（新）2003-0001。小鼠于實驗室動物房飼養，適應后用于免疫實驗。小鼠免疫實驗獲得了新疆生物資源基因工程重點實驗室動物實驗倫理委員會批準（批號BRGE-AE001）。

HFsafe-1200超凈工作臺、HF90二氧化碳培養箱（力康生物醫療科技控股有限公司），ELx808酶標儀（美國BioTek儀器有限公司），BD FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與免疫

采用9 g/L NaCl溶液溶解OVA，將Tween-20與9 g/L NaCl溶液按照體積比1∶9混合后用于溶解EECCD，過濾除菌后備用?？贵w實驗動物隨機分為7組（每組6只）：9 g/L NaCl組、EECCD組（1 200μg EECCD）、OVA組（10μg OVA）、低劑量EECCD/OVA組（400μg EECCD+10μg OVA）、中劑量EECCD/OVA組（800μg EECCD+10μg OVA）、高劑量EECCD/OVA組（1 200μg EECCD+10μg OVA）和Alum/OVA組（200μg Alum+10μg OVA）。于小鼠背部皮下三點注射，共免疫2次，間隔14 d，每次免疫前小鼠眼眶取血制備血清用于抗體檢測。由抗體實驗篩選出EECCD最佳劑量用于后續的脾淋巴細胞增殖、細胞因子、樹突狀細胞（dendritic cells,DCs）表面分子及Treg檢測。

1.2.2 間接酶聯免疫吸附測定法檢測小鼠OVA特異性抗體滴度和抗體分型

采用間接酶聯免疫吸附測定法檢測初免后14、28、42、56 d小鼠血清的IgG抗體滴度以及加強免疫后7 d小鼠血清的IgG抗體分型水平，具體操作參見文獻[11]。

1.2.3 噻唑藍法檢測小鼠脾細胞增殖

加強免疫后7 d，制備小鼠脾單細胞懸液，計數后調整細胞濃度，以適宜濃度接種于96孔細胞培養板中；分別加入適宜濃度的OVA、ConA和LPS與細胞共孵育48 h，以空白培養基組及未加刺激物的空細胞組作為對照，每組設3個復孔；加入噻唑藍溶液培養4 h，離心后加入二甲基亞砜溶解沉淀，酶標儀測定吸光度（A570/630nm）值，并按下式計算刺激指數

式中：A刺激組、A空白培養基組和A未刺激組分別為刺激組、空白培養基組和未刺激組的吸光度（A570/630nm）值。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞因子

采用流式細胞術對CD4+T細胞分泌IL-4和IFN-γ的水平進行檢測，步驟簡述如下：加強免疫后7 d，制備小鼠脾單細胞懸液加入細胞培養板中，與OVA抗原共刺激4 h后加入莫能霉素繼續培養過夜，同時設置佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA）刺激細胞為陽性對照；收集細胞，加入Fc封閉抗體封閉30 min，Perm/Wash緩沖液洗滌細胞；加入APC-CD4抗體進行細胞表面分子染色20 min，Perm/Wash緩沖液洗滌細胞；加入Cytofix/Cytoperm緩沖液固定破膜，Perm/Wash緩沖液洗滌細胞；分別加入適量的PE-IL-4和PE-IFN-γ抗體進行胞內染色20 min，Perm/Wash緩沖液洗滌細胞后加入磷酸鹽緩沖液，上流式細胞儀檢測。

1.2.5 流式細胞術檢測DCs表面分子和Treg細胞

加強免疫后7 d，制備小鼠脾單細胞懸液，使用PE-CD11c、FITC-CD40、APC-CD80、APC-CD86、FITCMHCⅡ抗體進行DCs表面分子染色15～20 min，洗滌細胞后加入磷酸鹽緩沖液，上流式細胞儀檢測。

加強免疫后7 d，制備小鼠脾單細胞懸液，采用CD4+CD25+Foxp3+Treg檢測試劑盒進行檢測，具體操作參見試劑盒說明書。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 5.0統計學軟件處理數據，符合正態分布的計量數據以均值±標準差（Mean±SD）表示。組間差異性采用單因素方差分析后用Turkey’s post-test進行多重比較，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 EECCD對小鼠體液免疫反應的影響

采用間接酶聯免疫吸附測定法檢測初免后14、28、42和56 d小鼠的血清IgG抗體滴度。結果如圖1所示，EECCD可提高小鼠血清IgG抗體滴度，表現為低、中、高劑量EECCD/OVA均提高了OVA特異性IgG抗體滴度，中劑量EECCD為最佳劑量；初免后不同時間點的抗體趨勢基本相同；初免后14 d，IgG抗體滴度整體偏低；初免后28 d，IgG抗體滴度達最大值，并與初免后42、56 d的IgG抗體滴度相當；初免后28 d，與OVA組相比，中劑量EECCD/OVA能提高OVA特異性IgG抗體滴度2.5倍（抗體滴度達25萬），且與Alum/OVA組相當，并持續至初免后56 d，抗體滴度無降低的趨勢；EECCD單獨免疫組的IgG抗體滴度與9 g/L NaCl組相當。

圖1 間接酶聯免疫吸附測定法檢測初免后不同時間點小鼠OVA特異性抗體滴度

2.2 EECCD對小鼠血清IgG1和IgG2a水平的影響

加強免疫后7 d，采用間接酶聯免疫吸附測定法檢測小鼠OVA特異性IgG1和IgG2a水平。結果如圖2所示，中劑量EECCD/OVA明顯提高了OVA特異性IgG1（Th2型免疫應答）水平（P<0.01），且與Alum/OVA組相比差異無統計學意義（P＞0.05）；中劑量EECCD/OVA和高劑量EECCD/OVA均明顯提高了OVA特異性IgG2a（Th1型免疫應答）水平（均P＜0.01），且中劑量EECCD/OVA組高于Alum/OVA組（P＜0.01）；與OVA組相比，Alum/OVA只能提高OVA特異性IgG1水平（P＜0.01），對IgG2a水平無明顯影響（P＞0.05）；與OVA組相比，低劑量EECCD/OVA明顯提高了IgG2a/IgG1比值（P<0.01）。由此篩選出中劑量EECCD/OVA組為最佳劑量組。

圖2 間接酶聯免疫吸附測定法檢測加強免疫后7 d小鼠血清抗體亞型

2.3 EECCD對小鼠脾細胞增殖的影響

將中劑量EECCD與OVA共免疫后，制備小鼠脾單細胞懸液，分別用OVA、ConA和LPS體外刺激細胞，觀察EECCD對脾細胞增殖的影響。結果顯示，與OVA組相比，中劑量EECCD/OVA明顯促進了OVA特異性的脾細胞增殖（P＜0.05）（圖3A）；ConA和LPS體外刺激結果顯示，中劑量EECCD/OVA明顯促進了T/B細胞的增殖（均P＜0.05）（圖3B、3C）。

圖3 噻唑藍實驗檢測加強免疫后7 d小鼠脾淋巴細胞的增殖情況

2.4 EECCD對CD4+T細胞分泌IL-4和IFN-γ的影響

加強免疫后7 d，制備小鼠脾單細胞懸液，并以一定濃度的OVA抗原體外刺激脾單細胞懸液，同時以PMA刺激組為陽性對照，采用流式細胞術檢測CD4+T細胞分泌IL-4和IFN-γ的水平。由圖4可知，與OVA組相比，中劑量EECCD/OVA和PMA均能促進CD4+T細胞分泌IL-4（均P<0.01），且中劑量EECCD/OVA組與PMA組間差異無統計學意義（P＞0.05），中劑量EECCD/OVA組明顯高于Alum/OVA組（P＜0.01）；中劑量EECCD/OVA還能促進CD4+T細胞分泌IFN-γ（P＜0.01），且明顯高于Alum/OVA組（P＜0.01）；而OVA組與Alum/OVA組相比，CD4+T細胞分泌IL-4和IFN-γ的水平差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

圖4 流式細胞術檢測加強免疫后7 d小鼠CD4+T細胞分泌IL-4和IFN-γ的水平

2.5 EECCD對DCs成熟和Treg的影響

采用流式細胞術檢測加強免疫后7 d小鼠脾細胞中DCs表面分子CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表達，以及CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的表達。結果如圖5、6所示，與OVA組相比，中劑量EECCD/OVA能明顯促進CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表達，降低CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的表達，差異均具有統計學意義（均P＜0.05）。

圖5 流式細胞術檢測加強免疫后7 d小鼠脾細胞中DCs表面分子CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表達

3 討論與結論

中藥的有效成分可通過刺激或抑制作用來調節免疫反應，從而幫助機體維持健康狀態。中藥用于人類和動物疾病的防治有著悠久的歷史，尋找治療各類疾病的中藥有效成分一直是研究者們關注的重要課題。肉蓯蓉作為傳統補益類中藥是治療疾病的重要候選資源。文獻報道，肉蓯蓉醇提物中的主要活性成分為苯乙醇苷類化合物[12]，其在肉蓯蓉屬、紫丁香屬、毛冬青屬、車前草屬等植物中均有分布，具有抗氧化、抗炎和免疫調節作用[13-15]，對機體的免疫功能具有增強或抑制作用[16-17]，這說明不同中藥的苯乙醇苷類化合物的免疫調節作用存在差異。為此，本研究通過小鼠體內實驗對EECCD的免疫調節活性進行探索，結果發現EECCD可有效增強OVA特異性IgG、IgG1和IgG2a抗體的水平，激活OVA特異性的淋巴細胞增殖和T/B細胞的活化，促進CD4+T細胞分泌IL-4和IFN-γ，并可促進免疫后小鼠脾臟中DCs的成熟，抑制Treg的表達。上述結果提示EECCD對特異性免疫反應具有良好的免疫增強作用。

圖6 流式細胞術檢測加強免疫后7 d小鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg的表達

中藥有效成分的免疫調節作用呈現一定的量效關系。為了探究EECCD對體液免疫反應和細胞免疫反應的量效關系，本研究設置了低、中、高3個劑量的EECCD，分別與OVA共同皮下免疫小鼠?？贵w滴度結果表明，3個劑量的EECCD均可提高OVA特異性IgG抗體滴度，其中中劑量為最佳劑量，抗體滴度可達25萬，效果與Alum相當；中劑量EECCD/OVA能提高OVA特異性IgG1抗體水平，效果與Alum/OVA組相當；中、高劑量EECCD/OVA均能提高OVA特異性IgG2a抗體水平，效果優于Alum/OVA組，且EECCD無免疫原性。在抗體實驗結果的基礎上，脾細胞增殖實驗選擇了最佳劑量（中劑量）的EECCD檢測其效應，結果顯示中劑量EECCD/OVA可增強OVA特異性的脾細胞增殖，激活T/B細胞。上述實驗結果表明，EECCD在適宜劑量下可有效促進體液免疫反應和細胞免疫反應。

Th1和Th2型免疫應答是宿主保護性免疫所必需的，而Th1介導的細胞免疫應答是宿主抵抗某些傳染病的關鍵。中藥中的有效成分不僅可激活B細胞，還可激活T細胞反應。在本研究中，選擇了中劑量EECCD檢測其對CD4+T細胞分泌IL-4和IFN-γ的影響。結果顯示，中劑量EECCD/OVA可促進Th2型細胞因子IL-4的分泌，效果與Alum/OVA組相當；中劑量EECCD/OVA還可促進Th1型細胞因子IFN-γ的分泌，效果優于Alum/OVA組。該結果與IgG1（Th2型免疫應答）和IgG2a（Th1型免疫應答）的結果一致，表明EECCD可促進Th1和Th2型免疫應答，尤其可提高Th1型免疫應答，這對于某些疾病的治療具有重要作用。

由于DCs在免疫調節中的重要作用，DCs常被作為中藥有效成分的免疫調節靶點[18]。研究結果也表明，中藥有效成分主要通過影響抗原遞呈細胞的成熟狀態及功能進而影響獲得性免疫反應[19-20]。Treg的減少可增強體液和細胞免疫應答，并在保持免疫系統平衡中起到了重要的調節作用。為了進一步了解EECCD的免疫調節活性，本研究檢測了中劑量EECCD/OVA免疫后小鼠脾細胞中DCs表面分子的表達和Treg水平。結果顯示，中劑量EECCD/OVA上調了DCs表面分子CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表達，下調了小鼠脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg的表達。該結果表明，EECCD可通過促進DCs成熟和抑制Treg細胞活化來提高OVA特異性的體液和細胞免疫應答。

總之，EECCD不僅可提高OVA特異性的體液和細胞免疫應答，促進IL-4和IFN-γ分泌，誘導DCs成熟，降低Treg表達，發揮良好的免疫增強作用，還可誘導Th1/Th2型免疫應答，尤其可誘導Th1型免疫應答，可作為一種有效的免疫調節成分候選資源用于疾病的防治。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突