MCM4/PCNA在胃癌組織中的表達及作為潛在生物標志物的可能性研究

李小龍 宋瑞 李思 李曉寧 郭蘭栓

1保定市第一中心醫院普通外一科 071000；2保定市第一中心醫院普通外二科 071000

0 引言

胃癌是公認的高惡性度、進展迅速的消化道癌癥[1]。根據美國2021年的統計數據，導致患者死亡的最常見原因仍然是心血管疾病，其次就是癌癥，但兩者差距正在逐漸縮小[2-3]。胃癌的死亡率很高，美國在2021年約有26 560例新發病例，包括男性16 160例，女性10 400例；死亡病例11 180例，包括男性6 740例和女性4 440例[4]。由于胃癌的進展迅速，許多患者在發病早期并無明顯癥狀，往往在診斷時已達晚期，導致其5年生存率很低。近年來，隨著醫學技術的快速發展，胃癌患者的預后已經大大改善。以外科手術為基礎，聯合化學治療、放射治療、靶向治療以及內分泌治療的治療方法使胃癌患者的5年生存率大大提高，有的患者甚至能完全康復[5]。但是，目前臨床上對胃癌的診斷仍然缺乏靈敏的生物標志物，大部分胃癌患者是在具有明顯癥狀之后通過胃鏡檢查確診的，極易錯過最佳的治療時機[6-7]。因此，尋找靈敏且特異性高的胃癌診斷生物標志物對于胃癌的診療具有極其重要的意義。

微小染色體維持蛋白4（mini-chromosome maintenance 4，MCM4）是高度保守的MCM蛋白，其對于真核生物基因組復制的啟動至關重要[8]。MCM蛋白形成的六聚體蛋白復合物是復制前復合物(preRC)的關鍵組成部分，可能參與復制叉的形成和其他DNA復制相關蛋白的募集。由MCM2、4、6和7組成的MCM復合物具有DNA解旋酶活性，可作為DNA解旋酶[9]。MCM4的紊亂與許多疾病的發生、發展顯著相關。例如，Issac等[10]發現MCM4可能是反映乳腺癌診斷和治療效果的一個良好指標；Xie等[11]發現MCM4在卵巢癌中上調并與患者的預后顯著相關，是卵巢癌的一個獨立預后因子；Yi等[12]發現MCM4是非小細胞肺癌發生、發展的一個驅動因子。上述研究結果表明，MCM4與眾多腫瘤的發生、發展顯著相關，靶向MCM4可能是治療這些癌癥的一個新的治療方向。但MCM4與胃癌之間的關系尚不清楚。因此，研究MCM4與胃癌之間的關系，進一步分析MCM4作為胃癌生物標志物的可能性具有重要意義。

增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）主要存在于細胞核中，是DNA聚合酶delta的輔因子[13-14]。其編碼的蛋白質充當同源三聚體，有助于增加DNA復制過程中前導鏈合成的持續合成能力。此外，PCNA還可作為對DNA損傷的響應，被泛素化并參與依賴RAD6的DNA修復途徑[15]。很多研究結果證明，PCNA與許多腫瘤細胞的異常增殖明顯相關，PCNA的紊亂可能是部分腫瘤發生的內在機制。Smith等[16]通過研究證明，可通過靶向PCNA抑制胰腺癌的進展。Cui等[17]確定PCNA在甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）增高的肝細胞癌中顯著上調，并與其發展演變明顯相關。Cardano等[18]認為靶向PCNA對于抑制腫瘤細胞增殖是一個靈敏而有效的治療策略。He等[19]的研究結果表明，lncRNA AK027294能通過上調PCNA的表達量，從而進一步促進胃癌的進展。這些研究結果提示，PCNA可促進胃癌的發生和發展。

本研究中，主要探討MCM4與胃癌的關系，以及MCM4與PCNA的關系，以期為胃癌診療提供一個新的方向和有效的生物標志物或靶點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2011年5月至2021年5月，保定市第一中心醫院收治的經手術治療的胃癌患者69例。其中，男性35例，女性34例，年齡56.3歲±5.72歲。全部病例均經過臨床病理證實，并具有完整的病例資料。收集患者的胃癌組織與癌旁正常組織的石蠟標本，并收集患者的相關臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤分級、腫瘤大小。本研究中對所有患者標本的實驗研究均得到了患者的知情同意。此外，本研究基于1964年赫爾辛基宣言和隨后所有修訂案中規定的道德標準。

1.2 方法

1.2.1 主要材料與儀器

Anti-MCM4抗體、Anti-PCNA抗體（英國Abcom公司），3,3’-二氨基聯苯胺（DAB）（北京康為世紀生物科技有限公司）。RM2235型石蠟切片機、光學顯微鏡（德國徠卡公司）。

1.2.2 免疫組織化學檢測

根據免疫組織化學染色試劑盒的說明書進行免疫組織化學染色。將石蠟標本用切片機切片（厚度為4～5μm），將切片放入65℃的烤箱中烤片約45 min，以便于進一步脫蠟；水化處理時，將切片用二甲苯Ⅰ處理10 min，用二甲苯Ⅱ處理10 min，用無水乙醇處理5 min，用無水乙醇處理5 min，用95%的乙醇處理5 min，用85%的乙醇處理5 min，用75%的乙醇處理5 min；水化處理后，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌切片3次，每次約3 min；洗滌結束后，將切片置于裝有枸櫞酸鹽緩沖液的修復盒中，在微波爐中高火加熱5 min后斷電，再次以中低火加熱8～10 min，進行抗原修復；將修復盒取出，在室溫下冷卻至常溫，整個過程中保持玻片被修復液浸泡；繼續用PBS洗滌切片3次，每次3 min；將切片周圍多余的水分用濾紙吸干，再在標本上滴加過氧化物；將切片放于濕盒中，室溫孵育約15 min以消除內源性過氧化物酶；擦干切片周圍多余的液體后，用PBS洗滌3次，每次約3 min；稍微用力甩干多余液體，滴加特異性一抗并均勻涂布，然后置于濕盒中在4℃冰箱中孵育過夜；次日，將濕盒取出復溫，用PBS洗滌3次，每次約5 min；用濾紙擦干切片上的多余水分，然后在標本上滴加IgG二抗工作液，均勻涂布后置于濕盒中，于室溫下孵育25 min左右，再以PBS洗滌3次，每次約3 min；滴加事先配制的DAB染色液，于室溫下顯色，控制反應時間在5～8 min，用自來水沖洗以終止染色；用濾紙吸干切片上的多余水分，滴加蘇木素工作液，進一步復染細胞核，控制染色時間為5～10 s；用自來水再次終止染色，隨后進行梯度脫水[75%乙醇10 s→85%乙醇10 s→95%乙醇10 s→無水乙醇10 s→無水乙醇5 min→二甲苯（Ⅲ）5 m in→二甲苯（Ⅳ）5 min]；最后用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察。

1.2.3 臨床樣本生物信息學分析

通過基因表達譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數據庫，驗證胃癌組織中MCM4 mRNA的表達水平（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=MCM4）和PCNA mRNA的表達水平（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=PCNA），并分析胃癌組織中MCM4與PCNA之間的關系。

1.3 統計學方法

采用Graphpad統計學軟件處理數據。定量數據采用均值±標準差（Mean±SD）表示。比較臨床病理特征與MCM4和PCNA表達間的關系時，采用χ2檢驗；兩組間進行比較時使用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MCM4在各種腫瘤組織中的表達

生物信息學分析結果顯示，MCM4在結直腸癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌組織中免疫組化染色呈陽性（圖1）；MCM4在多數腫瘤中呈現中高度表達，尤其是膠質細胞瘤，而在肝細胞癌、前列腺癌以及子宮內膜癌中呈低表達（圖2）。

圖1 微小染色體維持蛋白4（MCM4）在幾種常見腫瘤中的免疫組化結果（×200）

圖2 微小染色體維持蛋白4（MCM4）在部分腫瘤中的表達情況

2.2 MCM4在胃癌組織中的表達情況

通過GPEIA數據庫分析MCM4 mRNA在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達情況，共分析胃癌組織408例及癌旁正常組織211例。結果表明，MCM4在胃癌組織中高表達（P＜0.05）（圖3）。該結果提示，MCM4可能是胃癌的一個獨立生物標志物，可通過檢測MCM4的表達量來預測胃癌的發生，還可進一步探索是否可通過靶向MCM4來治療胃癌。

圖3 微小染色體維持蛋白4（MCM4）的mRNA在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達情況

為了進一步驗證生物信息學分析結果，共對69例胃癌組織標本進行免疫組織化學染色，并分析MCM4的表達量。結果表明，MCM4在胃癌組織中的表達量明顯高于癌旁正常組織（圖4），這與生物信息學分析結果一致。為了進一步探討MCM4的表達量與胃癌進展之間的關系，將69例胃癌組織標本根據染色強度分為高、低兩組，分析比較MCM4高表達組和MCM4低表達組患者的臨床病理特征差異，包括年齡、性別、腫瘤分級和腫瘤大小。表1中的數據表明，MCM4的表達與胃癌腫瘤大小明顯相關（P=0.037），而與患者年齡、性別和腫瘤分級的關系無統計學意義（均P＞0.05）。

圖4 胃癌組織和癌旁正常組織中微小染色體維持蛋白4（MCM4）的免疫組化結果

表1 微小染色體維持蛋白4（MCM4）的表達與胃癌患者臨床病理特征的相關性分析（例）

2.3 MCM4與PCNA的關系

前文中的研究結果已經證實MCM4可促進胃癌的發生和發展。為了進一步探討MCM4影響PCNA的方式，通過在線數據庫分析了與MCM4相關的一系列因子。結果表明，MCM4與許多重要的蛋白和因子相關，如PCNA、細胞周期素A1（Cyclin A1）和細胞分化周期蛋白6（cell division cycle 6，CDC6）（圖5）。PCNA是一個重要的增長相關因子，其紊亂會明顯影響腫瘤的發生、發展。在本研究中，通過在線數據庫預測了MCM4與PCNA的關聯性，發現MCM4的表達量與PCNA表達量顯著正相關（R=0.54，P<0.01；圖6）。因此，利用GEPIA數據庫進一步分析PCNA在胃癌組織中的表達情況。結果表明，在胃癌組織中，PCNA mRNA的表達量也明顯高于癌旁正常組織（圖7），進一步說明MCM4和PCNA具有密切的關系，MCM4表達上調可能通過進一步調節胃癌組織中PCNA的表達量，進而促進胃癌的發生、發展。但是，具體機制有待于進一步研究。

圖5 與微小染色體維持蛋白4（MCM4）相關的蛋白和因子的網絡分析結果

圖6 微小染色體維持蛋白4（MCM4）與增殖細胞核抗原（PCNA）的相關性

圖7 增殖細胞核抗原（PCNA）的mRNA在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達情況

2.4 MCM4與PCNA的免疫組化結果比較

為了進一步驗證MCM4和PCNA的關系，將69例胃癌組織切片進行MCM4和PCNA的免疫組化染色。結果表明，胃癌組織中MCM4和PCNA蛋白均高表達（圖8）。該結果與生物信息學分析結果一致，進一步說明二者之間存在緊密聯系，并可能協同促進胃癌的發生和發展。

圖8 胃癌組織中微小染色體維持蛋白4（MCM4）與增殖細胞核抗原（PCNA）的免疫組化結果

3 討論與結論

胃癌是一種具有高致死率的惡性消化道腫瘤，其早期一般無明顯癥狀，很多患者在確診之時即為晚期，導致5年生存率很低。能誘發胃癌的因素很多，其中研究得比較多的是吸煙[20]、家族史[21]和不良飲食習慣[22]，其中飲食中的各種毒素是顯著因素。隨著醫療技術的不斷發展，胃癌患者的生存率已經大大得到提升，但發病人數不斷增長，這與逐漸精密的檢測儀器和不健康的生活方式明顯相關[23]。

早期診斷和有效治療是降低胃癌死亡率的最根本要素。因此尋找一種靈敏且有效的生物標志物對于提升胃癌的診療水平至關重要。研究結果表明，MCM4與多種腫瘤的發生、發展相關[24-25]，靶向MCM4可抑制結直腸癌的發生、發展[26]。本研究結果表明，MCM4在很多腫瘤中顯著上調，且MCM4在胃癌組織中的表達量明顯高于癌旁正常組織，進一步分析患者的臨床資料發現，MCM4的表達與胃癌腫瘤大小相關（P<0.05），而與患者性別、年齡及腫瘤分級的相關性無統計學意義（均P＞0.05）。上述結果提示，MCM4可能是胃癌的一個獨立預后因子。

此外，很多研究結果表明，PCNA與腫瘤的發生和發展相關，靶向PCNA能有效抑制腫瘤的進展。Li等[27]發現MicroRNA-204能有效通過靶向PCNA來抑制肺癌細胞的增殖和侵襲；Hou等[28]發現食管癌相關基因2（es ophageal cancer related gene 2，ECRG2）能通過上調p53和下調PCNA來增強順鉑對順鉑耐藥食管癌細胞的作用；還有研究者發現PCNA與胃癌的發生、發展具有明顯的關聯性。在本研究中，通過GEPIA數據庫證實MCM4與PCNA顯著相關。此外，PCNA在胃癌組織中的表達量也明顯高于癌旁正常組織，該結果與MCM4在胃癌組織中的表達情況一致。69例胃癌組織的MCM4與PCNA的免疫組化結果表明，在胃癌患者中，MCM4的表達情況與PCNA的表達情況一致，進一步證明了二者具有顯著的相關性，二者可能協同促進胃癌的發生、發展。

綜上所述，MCM4可能通過調節PCNA促進胃癌的發生、發展，MCM4和PCNA可能是胃癌的潛在生物標志物。本研究結果為研究靶向MCM4治療胃癌提供了新的方向和思路。但由于本研究屬于單中心小樣本研究，在樣本量方面存在不足。未來將進一步探究MCM4與胃癌之間的關系，通過基因操作技術構建MCM4表達載體，通過過表達或者敲低來改變MCM4的表達量，分析其對胃癌細胞的功能學影響。此外，將構建小鼠模型對本研究結果進行進一步的驗證，以進一步揭示MCM4與PCNA的相互作用和MCM4、PCNA對于胃癌的具體作用機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突