臨床級人臍帶間充質干細胞資源庫的構建

趙慶輝 白志慧 賈文文 湯紅明 劉中民

同濟大學附屬東方醫院干細胞轉化醫學產業基地，國家干細胞轉化資源庫，上海干細胞臨床轉化研究院，上海市干細胞臨床診療工程研究中心，上海 200123

0 引 言

干細胞療法正在突破傳統醫學，對于一些人類重大難治性疾病[1-2]的治療表現出獨特優勢，近年來已受到全球范圍內關注，成為國際前沿戰略性研究領域。

人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）是一類存在于新生兒臍帶組織中的具有較高分化潛能的多能干細胞[3]。在一定條件下，hUC-MSCs可分化成多種功能組織和器官。因具有多向分化潛能、低免疫原性和黏附特性[4-7]以及材料來源豐富和較少倫理學爭議，hUC-MSCs逐漸成為再生醫學療法和組織工程移植的理想種子細胞之一[8-9]，越來越受到研究者的青睞。

截至2020年12月20日，以“hUC-MSCs”為關鍵詞，在全球最大的臨床試驗數據庫ClinicalTrials.gov網站檢索，結果顯示全球約有275項關于hUCMSCs移植治療相關疾病的臨床試驗。在國家衛生健康委員會和國家食品藥品監督管理總局備案的100項干細胞臨床研究項目中，選擇hUC-MSCs作為干細胞制劑的有45項，占比達45%，治療的適應證包括新型冠狀病毒肺炎（新冠肺炎）、心血管疾病、糖尿病、骨科疾病、神經系統疾病及自身免疫性疾病等人類重大疾病。2008至2019年期間，在中國臨床試驗注冊中心注冊的354項干細胞相關臨床試驗中，選擇hUC-MSCs作為干細胞制劑的有56項，占比達16%。鑒于此，建立臨床級hUC-MSCs（可達到用于臨床的相關質量標準）資源庫尤為關鍵，其不僅可為干細胞臨床研究和應用服務，也可為高校、科研院所、企事業單位等提供滿足科學研究所需的干細胞資源[10]。

作為國家干細胞轉化資源庫承建單位，同濟大學附屬東方醫院早在2017年便啟動了臨床級hUCMSCs的制備和建庫工作。本研究旨在通過分離、培養、擴增、傳代、凍存等操作流程，并對hUC-MSCs進行生物學特性、安全性與穩定性等質量檢測，建立臨床級hUC-MSCs資源庫三級庫，以期為科學研究、臨床轉化與應用以及國家應急等提供資源保障和支撐[11]。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

質量濃度為9 g/L的NaCl溶液（國藥集團化學試劑有限公司），凍存液（加拿大Stemcell公司），α-MEM培養基、臺盼藍染色液、MesenCultTM成脂分化培養基、MSCgoTM成骨誘導分化試劑、StemPro成軟骨分化試劑盒（美國Gibco公司），UltraGROTMAdvanced完全培養基（美國Helios公司），鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司），MSC Phenotyping Kit（間充質干細胞表型檢測試劑盒，上海優寧維生物科技股份有限公司），GoTaq qPCR Master Mix（支原體熒光定量PCR檢測試劑盒，美國Promega公司），茜素紅、阿利新藍、油紅O（賽業生物科技有限公司），基質膠（美國BD公司），CCK-8試劑盒（美國MCE公司）。

雄性非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫缺陷（nonobese diabetes/serve combined immunodeficiency,NOD/SCID）小鼠6只，無特定病原體級，5～8周齡，體質量約15 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號SCXK（京）2021-0011。飼養條件為溫度18～22℃，相對濕度50%～60%，每周更換2次墊料，飼養環境干凈整潔。本研究的動物實驗已通過同濟大學醫學院實驗動物中心審查。

人臍帶組織來源于同濟大學附屬東方醫院產科，要求捐贈者身體健康，無系統性疾病及其他遺傳性疾病，相關病原學檢查結果均為陰性，合格者納入。目前本研究共納入捐贈者247例（計劃500例）。臍帶組織采集前，捐贈者均簽署知情同意書，并統一編碼，保護捐贈者個人隱私。采集完成后，將臍帶組織浸入質量濃度為9 g/L的NaCl溶液中，并低溫運輸至藥品生產質量管理規范（GMP）實驗室。本研究已通過同濟大學附屬東方醫院倫理委員會審查，倫理批件號為[2017]體臨審第（001）號修正1。

1374生物安全柜、371細胞培養箱、7500 Fast熒光定量PCR儀（美國Thermo公司），TS100倒置顯微鏡（日本尼康公司），IC1000細胞計數儀（上海睿鈺生物科技有限公司），Bact Alter梅里埃微生物培養系統（法國梅里埃公司），FACSCantoⅡ流式細胞儀（美國BD公司），DHP-9162恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 hUC-MSCs建庫流程

按照《中華人民共和國藥典》及干細胞相關規范和指南等，結合hUC-MSCs特性，依次建立種子細胞庫（選取P1代細胞）、主細胞庫（選取P3代細胞）和工作細胞庫（選取P5代細胞），并進行相關質量檢測（圖1）。

圖1 hUC-MSCs建庫流程

1.2.2 hUC-MSCs種子細胞庫的建立

沖洗采集的人臍帶組織，將其剪成1～2 cm小段，并剔除其中的3根血管（2根動脈和1根靜脈）。將剔除血管的臍帶剪成1～2 mm3的組織塊，采用無血清培養基進行貼壁培養。經消化后獲得P0代細胞，再進行傳代、擴增獲得P1代細胞，放行檢驗合格后即為hUC-MSCs種子細胞。

1.2.3 hUC-MSCs主細胞庫的建立

對P1代種子細胞進行逐級傳代、擴增，獲得P3代細胞，放行檢驗合格后形成hUC-MSCs主細胞庫。

1.2.4 hUC-MSCs工作細胞庫的建立

對P3代細胞再次進行傳代、培養、擴增，獲得P5代細胞，放行檢驗合格后形成hUC-MSCs工作細胞庫。

1.2.5 hUC-MSCs質量檢測

根據國家衛生計生委與國家食品藥品監督管理總局頒發的《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則（試行）》、國家食品藥品監督管理總局頒發的《細胞治療產品研究與評價技術指導原則（試行）》以及行業協會發布的《干細胞制劑制備與質檢行業標準（試行）》《干細胞通用要求》等相關質量控制技術規范要求，按照相關檢測方法[11-13]，對建庫的hUC-MSCs進行生物學特性、安全性與穩定性等檢測，內容包括但不限于細胞鑒定、存活率及生長活性檢測、純度和均一性檢測、細胞內外源致病因子檢測、無菌和支原體檢測、內毒素檢測、成瘤性檢測、生物學效力檢測、異常免疫學反應檢測等，以確保hUC-MSCs細胞株質量可控。

（一）細胞鑒定

采用顯微鏡觀察不同代次細胞的狀態并拍照。

（二）細胞存活率檢測

將質量濃度為40 g/L的臺盼藍染色液與細胞懸液混合，采用細胞計數儀進行計數，并計算細胞存活率。

（三）細胞純度和均一性檢測

將P5代細胞懸液以2.5×105個/管均分至EP管中，單染抗體CD11、CD19、CD34、CD45、人類白細胞抗原DR（human leukocyte antigen-DR，HLA-DR）各取5μl，CD73、CD90、CD105各取1.25μl加入對應的EP管中進行染色，棄上清，杜氏磷酸鹽緩沖液重懸后轉移至流式管中，最后采用流式細胞儀進行檢測。

（四）細胞內外源致病因子檢測

采用定量PCR方法檢測細胞培養上清中是否含有細胞內外源致病因子，具體操作參見文獻[12]。

（五）無菌和支原體檢測

取適量P1、P3、P5代細胞培養上清，分別加入需氧培養瓶和厭氧培養瓶中，再置于全自動微生物培養檢測系統，37℃培養5 d。

取適量P1、P3、P5代細胞培養上清，采用支原體熒光定量PCR檢測試劑盒檢測支原體，具體操作按試劑盒說明書進行。

（六）內毒素檢測

取適量P1、P3、P5代細胞培養上清，采用鱟試劑（凝膠法）檢測內毒素，具體操作按試劑盒說明書進行。

（七）成瘤性檢測

將P5代細胞懸液加入EP管中，再加入100μl基質膠混勻，置于4℃冰盒待用。5～8周齡NOD/SCID雄鼠，稱質量分為2組，每組3只。剃除小鼠背部被毛，用預冷的胰島素針在其中一組小鼠背部兩點進行皮下注射HeLa細胞（每點2×106個），另一組小鼠皮下注射樣本細胞（每點2×106個）。2個月后觀察小鼠注射部位是否有成瘤組織。（八）生物學效力檢測

按相應的試劑盒說明書對P5代細胞進行成骨、成脂、成軟骨誘導分化21 d，再分別用茜素紅、油紅O、阿利新藍進行成骨、成脂、成軟骨染色觀察。（九）異常免疫學反應

將P5代細胞與淋巴細胞按照細胞數量1∶5共培養7 d，然后采用CCK-8試劑盒檢測淋巴細胞增殖情況。

2 結果

本研究共分離制備出247株hUC-MSCs。以其中一根臍帶制備的hUC-MSCs（編號ZB09AH）結果為例，本研究制備的hUC-MSCs具有以下特性。

2.1 細胞鑒定

顯微鏡下觀察可見，不同代次（P1、P3、P5代）的hUC-MSCs均呈梭形，生長良好，詳見圖2。

圖2 顯微鏡觀察人臍帶間充質干細胞（編號ZB09AH）的細胞形態（×40）

2.2 細胞存活率檢測

臺盼藍染色結果顯示，hUC-MSCs的細胞存活率＞95%。

2.3 細胞純度和均一性檢測

流式細胞術檢測結果見圖3，CD73、CD90、CD105陽性細胞比例均＞95%，CD11、CD19、CD34、CD45、HLA-DR陽性細胞比例均＜2%，表明制備的hUC-MSCs的純度和均一性良好。

圖3 流式細胞術檢測hUC-MSCs（編號ZB09AH）P5代細胞表面標志

2.4 細胞內外源致病因子檢測

熒光定量PCR檢測結果顯示，細胞內外源致病因子乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、Epstein-Barr病毒、巨細胞病毒均為陰性表達。

2.5 內毒素檢測

鱟試劑（凝膠法）檢測結果顯示，內毒素含量≤0.5 EU/ml。

2.6 無菌和支原體檢測

分別采用全自動微生物培養檢測系統和熒光定量PCR技術進行無菌和支原體檢測，結果均為陰性。

2.7 成瘤性檢測

NOD/SCID小鼠皮下注射hUC-MSCs不成瘤，詳見圖4。

圖4 非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫缺陷小鼠成瘤結果

2.8 生物學效力檢測

染色結果顯示，體外誘導培養21 d后，hUCMSCs具有分化成骨、成脂、成軟骨的能力（圖5）。

圖5 hUC-MSCs（編號ZB09AH）P5代細胞的成骨、成脂、成軟骨分化結果

2.9 異常免疫學反應

hUC-MSCs（編號ZB09AH）P5代細胞與淋巴細胞共培養結果顯示，ZB09AH P5代細胞對免疫細胞增殖抑制率為76%，表明ZB09AH P5代細胞具有抑制免疫細胞增殖的能力。

3 討論與結論

本研究通過分離、培養、傳代、擴增、凍存及質量檢測等一系列標準化操作流程，制備了247株hUC-MSCs細胞株（細胞數量規模近1萬份，后期可根據研究需求規?；瘮U增），建立了hUC-MSCs資源庫三級庫，即種子細胞庫、主細胞庫和工作細胞庫。三級庫中細胞數量分別為1×106個/管（凍存管規格為2 ml）、5×106個/管（凍存管規格為2 ml）和5×107個/袋（血袋規格為10 ml），并存儲于高效氣相液氮罐中。

本研究所用工藝制備的hUC-MSCs通過了中國食品藥品鑒定研究院質量復核檢驗（報告編號為SH201903852和SH201903853），達到了質量控制相關規定要求。同時已按照相關流程納入國家干細胞轉化資源庫，并在國家科技資源共享服務平臺共享，為干細胞相關科技創新活動提供了資源。

質量檢測合格的P5代細胞可用于臨床研究，使用前應對細胞制劑進行放行檢驗，包括但不限于無菌和支原體檢測、內毒素檢測等，檢測合格后方能使用。為保證臨床研究中干細胞制劑可溯源，本研究記錄了細胞流轉相關信息，包括捐贈者信息、樣本采集信息、細胞制備信息、細胞檢測信息、細胞入庫和出庫信息等。

目前，hUC-MSCs資源庫支撐1項科技部應對新冠肺炎應急攻關項目“應對新冠肺炎的間充質干細胞治療研究”（入組37例受試者，無1例不良反應）和2項國家干細胞臨床研究備案項目（“人臍帶間充質干細胞治療心衰的臨床研究”和“臍帶間充質干細胞治療2型糖尿病腎病的多中心臨床研究”），為臨床研究提供了hUC-MSCs資源及技術保障，并取得了初步進展。其中在應對新冠肺炎的干細胞臨床研究中，hUC-MSCs因具有重要的免疫調控與損傷修復調節作用，在輔助治療新冠肺炎（危）重癥患者時表現出獨特優勢，有效提高了病患的治愈率。該研究在2020年3月17日國務院聯防聯控機制新聞發布會上獲國家科技部生物中心肯定[14]?；谛鹿诜窝?、心衰和2型糖尿病腎病的hUC-MSCs臨床研究初探，有效加快了我國的干細胞臨床轉化與應用步伐。

眾所周知，干細胞資源庫作為干細胞與轉化研究的基石，在再生醫學研究、藥物研發與疾病診療等方面起到重要作用。而hUC-MSCs作為再生醫學和組織工程理想的種子細胞，在人類重大疾病治療中表現出獨特的優勢，受到了廣泛關注。本研究建立的hUC-MSCs資源庫和應用初探勢必加速我國干細胞資源庫的標準化建設以及干細胞的臨床轉化，其不僅可為干細胞臨床研究和應用服務，也可為基礎科學研究和國家應急等提供資源保障和支撐。這對于現階段我國全力推進干細胞產業化，加快醫療新技術在臨床中的轉化與應用具有重大現實意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突