脊髓灰質炎病毒受體與胃癌患者預后的關系

孫成相 丁志海

1天津醫科大學中新生態城醫院普外科 300480；2天津市海濱人民醫院普外科 300280

0 引言

2018年的全球腫瘤統計報告顯示，胃癌的死亡率逐漸上升，在腫瘤相關死亡率中位居第2[1]。精準的腫瘤分期和預后判斷是腫瘤精準治療的基礎。美國腫瘤聯合委員會制定的TNM（tumor-lymph nodemetastasis）分期系統已在多種腫瘤分期中運用，為腫瘤的治療做出了重大貢獻。隨著診斷技術的進步和治療手段的豐富，胃癌的TNM分期系統也在不斷更新。外科手術是治療局限性胃癌的主要方法，但即使在根治性切除后仍然可能復發和轉移。眾多的圍手術期和輔助化療方案的應用，已經使胃癌患者的生存期大大延長。實際上，包括一些臨床驗證的生物標志物在內的臨床病理特征也應該考慮在治療決策中，來提供更好的預后分析和精準的抗腫瘤策略。為了開展更加精準的治療和預測胃癌患者的預后，臨床需要更加詳細和準確的策略[2-3]。

脊髓灰質炎病毒受體（poliovirus receptor，PVR）,又稱為CD155、Necl5或Tage4，位于人類19號染色體，有多種剪切變異體，其中最長的轉錄本由417個氨基酸組成。該基因編碼的蛋白質隸屬于免疫球蛋白超家族中的跨膜糖蛋白。其細胞外的結構域主要介導細胞與胞外基質的連接，細胞內的結構域主要與動力蛋白的輕鏈DYNLT1相互作用[4-5]。PVR在靈長類譜系中特異性表達，并且作為脊髓灰質炎病毒感染人體細胞的受體而備受關注[6]。對人體組織中的RNA測序后發現，PVR的mRNA在人體的多種組織和器官中表達，以腎上腺，肺和胎盤中表達量最高。近年來的研究結果表明，PVR在腫瘤的進展中也發揮著重要作用[7-9]。本研究中探究PVR與胃癌患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2015年1月至2016年12月在天津醫科大學中新生態城醫院和天津海濱人民醫院接受胃切除術的胃癌患者73例。其中，男性44例，女性22例，年齡（45.6±4.73）歲。收集患者的胃癌組織與癌旁正常組織的石蠟標本，并收集患者的相關臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤級別、腫瘤大小、淋巴結轉移情況和3年內腫瘤復發情況。納入標準：術后經病理診斷明確為胃腺癌；無其他惡性腫瘤；在就診醫院接受胃切除術；年齡大于18歲；具有完整的病歷資料。排除標準：術前接受過輔助化療；就診時已發生遠處轉移。

本研究涉及的所有患者資料及標本采集工作均得到了患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要材料與儀器

PVR抗體、免疫組織化學染色試劑盒（英國Abcam公司），蘇木素（北京索萊寶科技有限公司）。BX51體視顯微鏡（德國徠卡公司）。

1.2.2 免疫組織化學檢測

石蠟標本由病理科按照常規方法制作并保存。按4μm的厚度切片，然后附著于防脫玻片上，在60℃的烘箱內烘烤2 h。將玻片從烘箱取出后立即置于二甲苯溶液中浸泡15 min（2次），期間晃動玻片數次以充分溶解石蠟。抖去多余液體后，對玻片進行梯度乙醇溶液脫水：無水乙醇浸泡5 min；無水乙醇浸泡5 min；95%乙醇浸泡5 min；75%乙醇浸泡5 min。脫水后，將玻片放置于流動的自來水中沖洗5 min。之后，將玻片浸入pH為6.0的枸櫞酸鹽緩沖液中，再放置于微波爐內使液體沸騰10 min，進行抗原修復。之后，等待溶液自然冷卻至室溫，再加入內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育10 min。將玻片在磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中沖洗3次，每次5 min。滴加山羊血清，室溫孵育15 min，封閉非特異性的結合位點。棄去血清后直接滴加經抗原稀釋液稀釋后的一抗（1∶100），置于濕盒內，置于4℃環境中孵育過夜。用PBS清洗后，加入生物素標記的羊抗兔二抗，室溫孵育15 min。用PBS清洗后，加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育10 min。用PBS洗凈后，滴加二氨聯苯胺（diamio benzidine，DAB）顯色液，每個玻片均顯色2 min。用流動自來水沖洗玻片5 min后，用蘇木素染料染色3 min，再用鹽酸乙醇溶液分化，直至氨水返藍。將玻片依次放入75%乙醇，95%乙醇，無水乙醇中各脫水2 min，再放于二甲苯中透明處理10 min。最后用中性樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察。

根據免疫組織化學染色試劑盒的說明書對組織標本切片進行免疫組化染色。PVR的表達量由2名獨立的病理醫師根據免疫組織化學切片進行判斷。顯微鏡觀察時，每個切片隨機選取5個視野，依照陽性細胞比例和和陽性染色強度2個指標評定組織切片中PVR的染色水平。陽性細胞比例評分標準：腫瘤細胞陽性百分數為0%時，記為0分，1%～29%時，記1分，30%～60%，記2分，＞60%時，記3分。陽性染色強度評分標準：無染色記0分；弱染色記1分；中度染色記2分；高度染色記3分。以陽性細胞百分比評分和染色強度評分的乘積判斷表達情況，其中結果≥6分為高表達組，結果＜6分為低高表達組。

1.2.3 生物信息學分析

使用R語言，根據腫瘤基因組圖譜（thecancer genome atlas，TCGA）中的胃癌患者數據繪制PVR基因表達箱式圖。使用R語言中的RTCGA包和RTCGA.mRNA包獲取各個樣本中的PVR表達數據，使用dplyr包對獲取的數據進行整理，使用ggplot2包和ggsignif包進行基因表達箱式圖的繪制和統計檢驗。

通過基因表達譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數據庫（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=PVR）和癌癥基因組圖集（the cancer genome atlas，TCGA）數據庫進行生物信息學分析?？偵嫫冢╫verall survival，OS）定義為從隨機化分組開始到任何原因引起患者死亡的時間；無病生存期（disease-free survival，DFS）定義為從隨機分組開始到疾病復發或者由于疾病進展導致患者死亡的時間。使用Kaplan-Meier方法進行曲線繪制，以基因表達中位數來劃分高表達和低表達，用虛線標記95%置信區間，并顯示風險比（hazards ratio，HR）。

1.3 統計學方法

采用Graphpad統計學軟件處理數據。PVR高表達和低表達患者的總生存期和無病生存期比較采用時序檢驗（Logrank）方法；比較患者PVR表達量和病理信息相關性時，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PVR在胃癌組織中的表達及與預后的關系

利用TCGA數據庫中的胃癌隊列，分析PVR mRNA在胃癌組織中的表達情況，共納入了408例胃癌標本和211例癌旁正常組織標本。如圖1所示，PVR mRNA在胃癌標本中明顯高表達，差異有統計學意義（P<0.05）。進而使用GEPIA分析了胃癌患者PVR表達量與患者預后之間的關系。由Kaplan-Meier生存曲線可知，PVR表達量較高的患者中，總生存率（P=0.011）和無病生存率（P=0.032）均較低（圖2A和2B）。上述結果提示，PVR在胃癌組織中的表達水平較高，且PVR的表達與胃癌患者的生存期相關。

圖1 胃癌組織中脊髓灰質炎病毒受體（PVR）的mRNA表達情況

圖2 脊髓灰質炎病毒受體（PVR）的表達與胃癌患者生存期的相關性

2.2 PVR在胃癌組織中的表達

為了進一步探究PVR在胃癌進展中的作用。本研究中，運用免疫組化染色法檢測73例胃癌組織中PVR的表達情況。結果顯示，PVR主要表達在胃癌細胞的細胞膜上，在間質中不表達，而PVR在癌旁正常組織中基本不表達。

根據染色強度，將胃癌患者分為PVR高表達組和PVR低表達組（圖3A）。比較后發現，PVR在癌旁正常組織中的表達量顯著降低（圖3B）。上述結果提示，PVR在胃癌的進展中發揮重要作用。

圖3 胃癌組織和癌旁正常組織中脊髓灰質炎病毒受體（PVR）的免疫組化染色結果

2.3 PVR表達水平與胃癌患者的臨床病理特征的相關性

為了闡明PVR在胃癌進展中的作用，分析比較了PVR高表達組和PVR低表達組患者的臨床病理特征差異，包括年齡、性別、腫瘤級別、腫瘤大小、淋巴結轉移情況和腫瘤復發情況。PVR高表達組和PVR低表達組患者在性別和年齡上的差異無統計學意義（均P＞0.05），保證了兩組具有可比性。分析結果顯示，PVR表達與胃癌患者的腫瘤大?。≒=0.001）和3年內復發情況（P=0.013）的相關性有統計學意義，而與腫瘤級別、淋巴結轉移情況的相關性無統計學意義（均P＞0.05）。（表1）

表1 脊髓灰質炎病毒受體（PVR）蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的相關性分析（例）

3 討論與結論

PVR最初被重視是因為其介導了脊髓灰質炎病毒感染人體細胞。近些年的大量研究結果表明，PVR不僅與病毒感染有關，而且與腫瘤的增值侵襲和免疫系統等也有緊密的聯系。

本研究中通過生物信息學分析，發現PVR mRNA在胃癌組織中表達明顯上調。進而使用免疫組化染色法分析了PVR在73例胃癌患者組織中的表達情況，結果表明PVR蛋白在胃癌組織中表達上調，而在癌旁正常組織中不表達或低表達。多項研究結果表明，PVR在人類的多種腫瘤中表達上調。有研究者利用免疫組化法分析了134例胰腺癌組織中PVR的表達情況，發現PVR在胰腺癌組織中高表達，且與預后、腫瘤免疫力和血管生成有關。本研究中，通過生存分析得知，PVR mRNA的表達量與胃癌患者的預后負相關。對73例胃癌患者臨床資料的回顧性分析結果也表明，PVR表達量越高，患者腫瘤體積越大且更容易復發。此外。多項研究結果證實，PVR的表達情況與肺腺癌、軟組織肉瘤、黑色素瘤、結腸癌等多種癌癥的預后相關[10-15]。

迄今為止，研究者尚未完全闡明PVR在人類生理和病理中的確切作用。特別是在腫瘤的發生和發展中，PVR的功能在很大程度上都是不清楚的。在免疫學功能上，先前的研究結果表明，PVR既可以發揮抑制作用，同時也具有刺激和激活免疫的作用。PVR與DNAM-1相互作用刺激體內的免疫細胞產生抗腫瘤作用[16]。然而，最近的幾項研究結果表明，TIGIT結合PVR并抑制T細胞和NK細胞的活性，抑制細胞因子的分泌，如干擾素γ，腫瘤壞死因子α[17-21]。在轉化的早期階段，腫瘤細胞上PVR的表達主要促進抗腫瘤免疫功能，而在晚期則支持腫瘤生長和免疫逃逸。

在惡性轉化的信號中，成纖維細胞生長因子受體或致癌性Ras突變的刺激激活了Ras-Raf-MEKERK信號通路的轉錄程序，最終導致CD155轉錄誘導[22]。在Ras突變的細胞中，CD155的過表達影響了細胞的G0/G1期，并促進了腫瘤細胞的增殖[23]。盡管尚未確定所涉及的信號傳導分子，但CD155誘導的增殖信號需要胞質ITIM的參與，這表明該功能僅對CD155α亞型有效。CD155介導的信號傳導還可以與生長因子信號協同作用，以控制腫瘤的生長。例如，在NIH3T3細胞中，CD155增強了血小板衍生的生長因子誘導的細胞增殖，從而增強了Ras-Raf-MEK-ERK信號通路[24]。另外有研究者報道，CD155的抑制通過影響Bax和Bcl-2表達之間的比例來抑制結腸癌細胞的增殖并促進細胞凋亡[25]。

血管生成在腫瘤的生長和轉移過程中也起到了關鍵作用，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在腫瘤微環境中促進血管的生成[26-27]。有研究結果表明，PVR與VEGF受體2相互作用并調節VEGF誘導的血管生成[28]。針對胰腺癌的多項研究結果表明，PVR與血管生成和患者預后密切相關[28-30]。另外，PVR的體外阻斷不影響胰腺癌細胞系的VEGF的表達，腫瘤中的PVR可能通過VEGF的受體與其他分子的相互作用來調節血管生成，而不是直接與VEGF本身相互作用[28]。靶向VEGF的療法是治療幾種人類惡性腫瘤的標準療法，因此PVR和VEGF的聯合治療可對腫瘤發揮協同治療作用。

PVR與細胞周期和增值具有密切關系[23-24]。Nishiwada等[13]利用siRNA干擾技術在人胰腺癌細胞系中沉默了PVR，流式細胞術結果表明腫瘤細胞的增值受到明顯抑制，細胞阻滯在G2/M期。此外，沉默PVR對ERK、JNK和P38介導的MAPK通路也產生顯著影響[23-24,31]。

綜上所述，PVR在胃癌組織中過表達，高表達PVR的胃癌患者預后更差。因此，PVR水平對于胃癌患者的預后評價具有重要價值。本研究可為研發針對胃癌的PVR靶向療法提供理論依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突