siRNA干擾URG11表達對骨肉瘤細胞系MG63的生物學功能和Wnt/β-catenin信號通路的影響

董成功 張蔚 劉穎 張明

煙臺市煙臺山醫院病理科 264002

0 引 言

骨肉瘤是一種高度惡性的成骨性腫瘤，起源于間充質細胞，是腫瘤細胞直接形成骨樣基質的惡性腫瘤。骨肉瘤好發于青少年，可導致骨痛、肌肉萎縮、病理性骨折等一系列病變，給人體健康和生活質量構成重大威脅[1]。目前，盡管手術切除聯合術后放化療等治療手段使骨肉瘤患者的生存率有了很大提高，但一些復發和轉移病例的治療效果并不理想[2-3]。隨著分子生物學研究的不斷發展，從細胞分子水平上研究骨肉瘤發生、發展機制成為當代醫學領域的一大熱點。

上調基因11（up-regulated gene 11，URG11）可被乙肝病毒HBx蛋白上調，該基因含有特殊的植物凝集素結構域和血管黏附分子結構域，兩者參與了細胞黏附、遷移以及信號轉導等生物學活動的調節[4-5]。研究結果顯示，在肝癌、前列腺癌和腸癌等多種腫瘤的細胞和組織中，URG11異常高表達[6-8]。近些年來，有研究結果證實，骨肉瘤細胞也存在URG11表達上調，而且URG11高表達與腫瘤分期、肺轉移等臨床特征密切相關[5]，下調URG11能抑制細胞的惡性表型[9]。然而，URG11影響骨肉瘤細胞惡性表型的具體機制尚不明確。

Wnt是一類分泌型糖蛋白，通過自分泌或旁分泌途徑發揮作用。β-catenin是Wnt信號通路中的重要參與者，為多功能蛋白。研究結果顯示，Wnt/βcatenin參與了機體諸多生物學功能的調節，且Wnt/β-catenin信號通路的異常與腫瘤的發生、發展密切相關[10]。

本研究以人骨肉瘤細胞系MG63為研究對象，采用siRNA干擾URG11的表達，研究URG11對Wnt/β-catenin信號通路的調節與MG63細胞生物學功能的關系。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

MG63人骨肉瘤細胞系（美國ATCC公司），胰蛋白酶、胎牛血清（美國Gibco公司），1640培養基、青鏈霉素雙抗、聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、TRIZOL和脂質體2000（美國Invitrogen公司），通用蛋白裂解液（南京凱基生物科技發展有限公司），二辛可酸(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），羊抗兔/鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司），兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體和鼠抗人原癌基因（c-Myc）、基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），兔抗人周期性調控因子D1（Cyclin D1）、β-catenin、凋亡抑制基因（Survivin）單克隆抗體（美國CST公司），Matrigel基底膠（美國BD公司），Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（北京Solarbio公司），CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司），逆轉錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。

Transwell小室（美國Costar公司），酶標儀、凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司），恒溫CO2培養箱、熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PC R）分析儀（美國Thermo Fisher公司），流式細胞儀（德國Eppendorf公司），倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、分組與處理

MG63人骨肉瘤細胞系采用含10%熱滅活的胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的1640培養基進行培養（5%CO2、37℃）。實驗分為Control組（未轉染）、NC-siRNA組（轉染非特性NC-siRNA）和URG11-siRNA組（轉染URG11-siRNA）。收集處于對數生長期的MG63細胞，接種至24孔板（105個細胞/孔），常規培養。當細胞匯合度達70%左右時，根據廠商的說明書，采用脂質體2000進行瞬時轉染（每組3個復孔）。其中URG11-siRNA（5’-CACACCCAUUCCUCUACUU-3’）和NC-siRNA（5’-UUCUCCCAACCUCUCACCU-3’）由上海吉瑪公司合成。轉染后5 h，更換新鮮培養液，細胞繼續培養48 h，收集后進行后續檢測。

1.2.2 URG11 mRNA表達的檢測

采用逆轉錄PCR（reverse transcription PCR，RTPCR）法檢測URG11 mRNA表達。采用TRIZOL提取Control組、NC-siRNA組和URG11-siRNA組細胞的總RNA，并參照逆轉錄試劑盒的說明書合成單鏈cDNA。以1μl cDNA為模板，與各0.5μl正反引物、10μl SYBR Green Master Mix（2×）和8μl雙蒸餾水混合后配制成PCR反應體系（體積20μl）。PCR反應條件：預變性處理（95℃，2 min）；變性處理（95℃，20 s）；退火（60℃，30 s）；延伸（72℃，30 s）；共反應40個循環。采用比較CT（cycle-threshold）值法對樣品擴增進行計算，獲得各組細胞URG11 mRNA的樣本的相對表達量（2-ΔΔCT）。以GAPDH作為內參。PCR引物由上海生工生物合成，序列見表1，每組實驗重復3次。

表1 實時定量PCR引物序列

1.2.3 URG11蛋白表達的檢測

采用Western blot法檢測URG11的蛋白表達。采用蛋白裂解液提取各組MG63細胞的總蛋白，以BCA法檢測總蛋白濃度。向蛋白樣品中加入等體積的上樣緩沖液（loading buffer），充分混勻后于沸水中進行蛋白變性處理5 min。然后將熱變性后的蛋白樣品加至SDS-PAGE凝膠的齒狀槽中（每孔60μg）行電泳分離。分離結束后，將蛋白電轉至PVDF膜。PVDF膜經5%脫脂奶粉封閉2 h，然后分別采用URG11（1∶1 000稀釋）和GAPDH（1∶1 000稀釋）一抗進行孵育（4℃、24 h）。再經二抗工作液（1∶2 000稀釋）室溫孵育1 h后，暗室內顯影曝光。采用凝膠成像分析儀掃描分析。每組實驗重復3次。

1.2.4 細胞增殖實驗

采用CCK-8法檢測細胞增殖。采用胰蛋白酶消化處理Control組、NC-siRNA組和URG11-siRNA組的細胞，離心后收集細胞，進而接種至96孔細胞板（200μl/孔；濃度為104個細胞/ml），每組設置3個復孔。細胞常規培養，分別在培養1 d、2 d、3 d和4 d時，棄培養液，加入CCK-8試劑（10μl/孔）后孵育2 h，采用酶標儀檢測各組細胞在490 nm處的吸光度。每組實驗重復3次。

1.2.5 細胞侵襲實驗

采用Transwell小室檢測細胞的侵襲性。以50 mg/L的Matrigel稀釋液（1∶8稀釋）包被Transwell小室底部，并在4℃下充分融合。將包被后的小室置于24孔板中，在小室上室中加入經無血清培養基重懸后的細胞（濃度為105個細胞/ml，200μl/孔），在下室中加入500μl含血清的培養基，每組設置3個復孔。細胞常規培養24 h后，取出小室，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌，以棉簽擦去上室細胞后分別采用4%多聚甲醛和0.5%結晶紫進行固定和染色。洗去染色液后，在顯微鏡下每孔隨機選取3個視野觀察侵襲穿膜細胞數量。每組實驗重復3次。

1.2.6 細胞凋亡實驗

采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。采用胰蛋白酶消化處理Control組、NC-siRNA組和URG11-siRNA組的細胞，離心后收集細胞，以磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次后，加入結合緩沖液600μl調整細胞濃度。向105個細胞中加入Annexin-V-FITC和PI各5μl，避光反應15 min后，補加上樣緩沖液200μl，用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。每組實驗重復3次。

1.2.7 Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達

收集URG11-siRNA組、NC-siRNA組和Control組細胞，采用Western blot法檢測Wnt/β-catenin信號通路相關分子（β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、MMP-2和Survivin）的蛋白表達。詳細的檢測步驟參照1.2.3節。

1.3 統計學方法

采用SPSS22.0軟件進行統計學分析。實驗數據以均值±標準差（Mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用SNKq，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 URG11-siRNA轉染后各組MG63細胞中URG11的表達

與Control組相比，URG11-siRNA組的MG63細胞中URG11 mRNA和蛋白表達均明顯降低（均P<0.05），而轉染NC-siRNA對MG63細胞的URG11表達的影響無統計學意義（均P＞0.05）。（圖1）

圖1 URG11-siRNA轉染對MG63細胞的上調基因11（URG11）蛋白和mRNA表達的影響

2.2 URG11-siRNA對MG63細胞增殖的影響

與Control組相比，URG11-siRNA組的細胞在轉染后2 d，細胞增殖開始明顯下調（P＜0.05）；而NC-siRNA組的MG63細胞在轉染1～4 d后，細胞的增殖活性與Control組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 URG11-siRNA轉染對MG63細胞增殖的影響（Mean±SD）

2.3 URG11-siRNA轉染對MG63細胞凋亡和侵襲的影響

URG11-siRNA轉染后，MG63細胞的凋亡率較Control組明顯升高，說明URG11-siRNA轉染明顯增強了MG63細胞的凋亡（P＜0.05）。但是Control組與NC-siRNA組的MG63細胞的凋亡率的差異無統計學意義（P＞0.05）。（圖2A和圖2B）

URG11-siRNA組的穿膜細胞數明顯少于Control組（P＜0.05），說明URG11-siRNA轉染使MG63細胞的侵襲能力明顯減弱。NC-siRNA組和Control組之間，穿膜細胞數的差異無統計學意義（P＞0.05），說明細胞的侵襲能力未明顯改變。（圖2C）

圖2 URG11-siRNA轉染對MG63細胞的侵襲和凋亡的影響

2.4 URG11-siRNA轉染對MG63細胞內的Wnt/β-catenin信號通路的影響

與Control組相比，URG11-siRNA轉染后，MG63細胞內的Wnt/β-catenin信號通路關鍵調控因子β-catenin及其下游靶基因c-Myc、Cyclin D1、MMP-2和Survivin的蛋白表達顯著下調（均P＜0.05），而NC-siRNA組的MG63細胞內的β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、MMP-2和Survivin的蛋白表達的變化無統計學意義（均P＞0.05）。（圖3）

圖3 Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的Western blot檢測結果

3 討論與結論

URG11基因位于人類11號染色體長臂，編碼70 ku的URG11蛋白。作為乙肝病毒HBx蛋白的效應器，URG11能促進肝癌細胞從G1期進入S期，加快肝癌細胞的生長，促進肝癌的發展[4，6]。隨著分子生物學研究的深入，多項研究結果表明，除了肝癌，URG11在其他腫瘤中的表達也存在上調。URG11在胰腺癌、乳腺癌中異常高表達，且與腫瘤浸潤、轉移和預后不良等臨床病理現象相關[11]。研究者也在其他腫瘤中發現，高表達URG11可以促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移，并抑制腫瘤細胞凋亡，從而導致腫瘤的進展和轉移[12-14]。研究結果顯示，骨肉瘤組織中，URG11表達上調，且URG11的高表達與腫瘤的分期、增殖能力和預后有密切相關性[5]，而下調URG11能抑制細胞的惡性表型[9]。本研究結果顯示，用siRNA干擾URG11表達可降低骨肉瘤MG63細胞的增殖、侵襲能力，并誘導細胞凋亡，這些結果與前人的研究結果一致，但URG11參與腫瘤細胞生物行為學調節的具體機制尚不明晰。

Wnt/β-catenin信號通路參與了機體內諸多生物學過程的調節。Wnt/β-catenin信號通路是細胞內進化上高度保守的Wnt通路的經典途徑，β-catenin是該通路的關鍵因子。β-catenin在胞漿中過度表達可進入細胞核，促進一系列腫瘤靶基因的表達，包括Cyclin D1、c-Myc、轉移相關基因MMP-2和Survivin等，從而影響腫瘤細胞的生長、遷移和凋亡等，與骨肉瘤等其他多種腫瘤的發生、發展密切相關[15]。研究結果顯示，Wnt配體和受體在骨肉瘤中表達增加，而Wnt拮抗分子在骨肉瘤中表達減少，這表明Wnt通路的激活與骨肉瘤密切相關[10]。靶向Wnt/β-catenin信號通路，有可能成為骨肉瘤的一種治療策略[16]。針對前列腺癌的研究結果顯示，抑制Wnt/β-catenin信號通路活化，可以減弱URG11的致癌作用[13]。針對肝癌的研究結果顯示，過度表達URG11可以促進Wnt/β-catenin信號通路關鍵因子β-catenin的轉錄，使β-catenin蛋白表達增加，從而促進肝癌細胞增殖[14]。為了探討URG11在骨肉瘤細胞系中的致癌分子機制，本研究中進一步研究了干擾URG11表達后，骨肉瘤MG63細胞系中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白（β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、MMP-2和Survivin）的表達情況。結果顯示，采用siRNA干擾URG11表達后，β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、MMP-2和Survivin蛋白表達顯著降低，提示URG11在骨肉瘤細胞系中的致癌機制可能與調控Wnt/β-catenin信號通路有關。

綜上所述，URG11在骨肉瘤發生、發展過程中發揮了重要作用，下調URG11表達，可抑制骨肉瘤MG63細胞增殖和侵襲，促進腫瘤細胞的凋亡，其分子機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化有關。因此，調節URG11的表達有可能成為骨肉瘤基因治療的一個重要方向，但臨床療效和具體生物學機制，還有待更多的研究來證實。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突