DHA藻油毒理學研究進展

蘭 韜,汪志明,趙 琳,陸姝歡,舒 敏,李翔宇,*

(1.中國標準化研究院農業食品標準化研究所,北京 100191; 2.嘉必優生物工程(武漢)有限公司,湖北武漢 430073)

二十二碳六烯酸藻油(Docosahexaenoic acid algal oil,DHA藻油)是采用裂壺藻(Schizochytriumsp.)或者吾肯氏壺藻(Ulkeniaamoeboida)或者寇氏隱甲藻(Crypthecodiniumcohnii)等藻種為原料[1-2],經生物發酵、提取、冬化、精制、脫色、除臭等過程制得富含DHA的油脂[3-4]。

DHA藻油中所含的DHA是一種對人體非常重要的ω-3不飽和脂肪酸[5]。它是神經系統細胞生長及維持的一種主要成分,是大腦和視網膜的重要組成成分,對胎嬰兒智力和視力發育至關重要[6-7],同時還有降低心腦血管疾病風險[8-10],緩解抑郁癥的功效[11]。DHA可以由α-亞麻酸合成,也可以直接從母乳、魚油或藻油中獲得[12]。其中DHA藻油具有DHA含量高、無重金屬污染、EPA含量較低、安全易吸收等優點而被廣泛應用[13]。

DHA藻油除了富含DHA外,還含有4%～5.6%的二十二碳五烯酸(DPA)以及19種飽和脂肪酸酯和24種不飽和脂肪酸酯等[14],還有一些不可皂化的角鯊烯、甾醇和類胡蘿卜素。其中DPA(ω-6)是人體飲食中的正常組成成分,牛肉、雞肉、蛋、豬肉以及大量海產品中都含有DPA。DHA所含的其他脂肪酸組分也較為安全,角鯊烯、甾醇和類胡蘿卜素等也都是常見的食品添加劑。所以可以認為DHA藻油中各主要成分基本都是安全的[15]。

目前DHA藻油已被廣泛應用于配方乳粉、保健食品等產品中,但其加工過程涉及藻類自然發酵過程,這一過程產生了DHA、DPA等重要營養物質,也增加了一定的安全風險。因此對DHA藻油的毒理學評價十分必要。而且目前還沒有對DHA藻油安全使用上限進行完整研究的報道。為確保其安全使用,本文將對DHA藻油的主要成分、臨床前動物毒理學研究、臨床毒理學研究進行介紹,確定DHA藻油的安全使用上限,以及作為食品原料需要注意的關鍵控制點,為監管部門、相應生產企業制定和推薦DHA藻油的日使用量提供了數據依據。

1 DHA藻油的毒理學研究

1.1 臨床前動物毒理學研究

DHA藻油臨床前動物毒理學實驗研究以裂壺藻、吾肯氏壺藻、寇氏隱甲藻為研究對象,主要實驗動物以大鼠為主,具體包括急性毒理學實驗、亞急性毒理學實驗、亞慢性毒理學實驗、慢性毒理學實驗等。研究中大多以生長情況、血液指標、臨床化學參數、大體病理學和組織病理學等作為考核指標,評估實驗動物食用DHA藻油后的安全性。下面按急性毒理學實驗、亞急性毒理學實驗、短期毒理學實驗、亞慢性毒理學實驗、生殖毒理學實驗、遺傳毒理學實驗等方面分別進行論述。

1.1.1 急性和亞急性毒理學研究 急性毒理學實驗是對化合物毒理學安全性評價的首要工作,可以了解機體一次或24 h內多次接觸該外源化合物后,在短期內(一般4～14 d)引起的中毒效應,在不同類型化學物的法規制定程序中是必做實驗[16]。急性毒理學實驗主要測定半數致死量(LD50),確定化合物的中毒方式、中毒反應,并為亞急性和慢性中毒實驗的觀察指標及劑量分組提供參考。亞急性毒性實驗是指機體在24 h～28 d內多次或連續暴露于外源化合物后出現的不良反應。檢驗受試驗物質(添加劑)的毒性對機體的重要器官或生理功能的影響,并估量發生影響的劑量,為慢性毒性試驗做準備[17]。

目前有較多DHA藻油原料都申請了美國FDA(Food and Drug Administration)的GRAS(Generally Recognized as Safe)食品,同時DHA藻油原料在申請我國國內新食品原料過程中,急性毒理學實驗數據都是必須提供的。鑒于此,DHA藻油的急性和亞急性毒理學實驗研究也較多,DHA藻油的急性和亞急性毒理學實驗設計和結論見表1。從表1可以看出,用寇氏隱甲藻和裂壺藻來源的DHA藻油在最高20000 mg/kg/bw的劑量下飼喂大鼠和豬14 d后,動物的生長、發育、血常規、尿常規、解剖后均未發現異常,說明對于大鼠和豬，其LD50大于20000 mg/kg/bw,寇氏隱甲藻和裂壺藻兩種來源的DHA藻油沒有表現出急性和亞急性毒性,這兩種來源的DHA藻油屬于實際無毒級別。

1.1.2 亞慢性和慢性毒理學研究 亞慢性毒理學實驗是機體在連續較長時間(相當于1/10生命周期,對于大鼠一般是90 d)接觸不同較大劑量(低于LD50)外源化合物后所產生的毒理學效應。慢性毒理學實驗是確定外來化合物的毒理學下限,即長期接觸該化合物可以引起機體危害的閾劑量和無作用劑量,對于大鼠一般是120 d。為進行該化合物的危險性評價與制定人接觸該化合物的安全限量標準提供毒理學依據,如最高容許濃度和每日容許攝入量等[24]。本文對DHA藻油動物亞慢性和慢性毒性實驗設計和結論進行了綜述,列于表2中,從表2中可以看出，寇氏隱甲藻、裂壺藻、吾肯氏壺藻三種藻種來源的DHA藻油在2000～4260 mg/kg/bw的喂食劑量下,飼喂大鼠90～120 d,大鼠沒有出現死亡,體重,食物消耗,行為,血液學,臨床化學,凝血或尿分析等參數未見異常,說明三種常見來源的DHA藻油的大鼠LD50大于4260 mg/kg/bw,三種常見來源的DHA藻油沒有表現出亞慢性和慢性毒性。

1.1.3 生殖、發育和遺傳毒理學研究 生殖、發育和遺傳毒性也是食品原料安全性的重要指標。多項研究證明DHA藻油沒有表現出生殖毒理學和發育毒理學。補充DHA藻油的樣品組和對照組相比,體現生殖能力的發情周期持續時間、生育率、妊娠長度和每胎幼崽數等參數沒有明顯差異。雌性動物接觸DHA藻油后,新生子代從出生到斷奶期間均未發現統計學上顯著的劑量依賴不良反應。大鼠或兔的子代器官發育、著床后胎兒死亡概率、平均胎兒體重或胎兒畸形情況沒有較大差異。一些研究采用體外或體內研究方法評估了DHA藻油的遺傳毒理學,所有致突變性和基因毒理學實驗結果均為陰性,可認為DHA藻油無遺傳毒理學。

表1 DHA藻油動物急性和亞急性毒理學實驗研究結果Table 1 Results of the acute and subacute animal oral toxicity tests of DHA algal oil

表2 DHA藻油動物亞慢性和慢性毒性實驗研究結果Table 2 Results of the sub-chronic and chronic animal oral toxicity tests of DHA algal oil

DHA藻油對于動物的生殖、發育和遺傳毒性研究結果表述見表3。從表3中可以看出,裂壺藻、寇氏隱甲藻、吾肯氏壺藻三種藻種來源的DHA藻油以最高20700 mg/kg/bw的喂食劑量飼喂大鼠,大鼠的發情周期,交配性能,生育力,妊娠期,分娩和妊娠指數、產仔數、后代體重、F1代的生理發育等生殖參數均沒有表現出異常,說明DHA藻油的無害作用劑量(NOAEL)可達20700 mg/kg/bw,可認為其沒有生殖毒性和發育毒性。

對幾種大鼠細胞進行了DHA藻油的給藥實驗,發現DHA藻油在給藥劑量為1000～5000 mg/kg時,沒有表現出致突變作用、骨髓毒性和遺傳毒性。

表3 DHA藻油動物生殖、發育和遺傳毒理學研究結果Table 3 Results of the reproductive,developmental and genetic animal oral toxicity tests of DHA algal oil

表4 DHA藻油臨床毒理學研究結果Table 4 Results of clinical toxicology of DHA algal oil

1.2 臨床毒理學研究

本文對裂壺藻來源的DHA藻油的臨床毒理學進行了匯總列于表4中。多項臨床實驗研究證明,DHA藻油在最高6000 mg/d的給藥劑量下,對人體無不良反應,添加DHA藻油后的嬰兒配方乳粉不會顯著影響嬰兒的生長。成人攝取DHA藻油后[34-40],攝入DHA不會對血小板功能或凝血產生不利影響,不會增加脂質過氧化,低劑量的DHA對免疫功能無影響,而基于DHA介導的某些免疫細胞功能在DHA攝入水平升高時受到抑制,當DHA攝入水平升高時,個體感染的風險可能更高。對于高血壓糖尿病患者,攝取劑量超過4000 mg/d的DHA后,對短期血糖控制有不良影響。

在最近的一項為期120 d的臨床研究中[41],足月兒在14～120 d的時間內被喂養含DHA配方乳粉(17 mg DHA/100 kcal)以評估對生長和耐受性的影響。在120 d的年齡段內,各性別的生長率沒有顯著差異。這項研究表明了DHA藻油對嬰兒的臨床安全性和耐受性。

綜上所述,DHA藻油對動物體和人體在較高的劑量范圍都是安全的。

2 DHA藻油產品質量關鍵控制點

目前對于DHA藻油的動物實驗和臨床實驗均建立在產品質量合格的DHA藻油原料基礎上,但DHA藻油的產品質量也存在一些關鍵控制點,包括重金屬和儲存條件等,若相應的關鍵控制點出現問題,也將影響DHA藻油產品質量,甚至產生毒副作用。

2.1 重金屬

DHA藻油主要采用培養海藻生產不飽和脂肪酸的微生物培養法。對于藻油來源的DHA,主要是在密閉的發酵罐中進行DHA的生產和富集,原料來源可控,本團隊采集了10種市售的DHA藻油樣品,并進行了鉛、砷、汞等重金屬含量的檢測,結果顯示這些藻油中均未檢出常見的重金屬,說明DHA藻油在重金屬方面沒有明顯安全隱患,應更加關注加工過程中其他外源性風險指標的控制[42-43]。

2.2 儲存條件

DHA屬于ω-3多不飽和脂肪酸,極易被氧化變質,氧化后的ω-3多不飽和脂肪酸食品會形成過不飽和脂肪酸食品,從而失去其商業和營養價值[44-45]。若長期過多攝入多不飽和脂肪酸油脂,會引起體內脂質過氧化反應上升和抗氧化酶活性降低[46-48],引發炎癥、動脈粥樣硬化、癌變[49-51]等。由于DHA藻油中含有豐富的胡蘿卜素類物質,所以DHA藻油具有很好的抗氧化效果,但在正常的生產和儲運過程中,依然需要注意增加適量的抗氧化劑(如維生素E、抗壞血酸棕櫚酸酯等)[52-53],以保證原料的功能性和安全性。

3 總結

本文對DHA藻油的急性、亞急性、亞慢性、慢性、生殖、臨床毒理學文獻進行了梳理,發現裂壺藻、吾肯氏壺藻、寇氏隱甲藻三種藻源發酵來源的DHA藻油在最高20700 mg/kg/bw劑量范圍內均未表現出相應的毒性,DHA藻油在最高6000 mg/d的給藥劑量下,對人體無不良反應,嬰兒攝取添加DHA藻油后的嬰兒配方乳粉不會顯著影響嬰兒的生長。DHA藻油作為食品原料，應重點關注加工過程中其他外源性風險指標的控制,同時在儲運貯藏過程中,應注意增加適量的抗氧化劑(抗壞血酸棕櫚酸酯和維生素E)以保證原料的功能性和安全性。本文梳理的結果對于監管部門、相應生產企業制定和推薦DHA藻油的日使用量提供了數據依據。