魚粉加工壓榨液中EPA和DHA富集工藝優化及其特性分析

曹少謙,孫 程,秦偉力,褚盈雁,李沖沖,王正東,戚向陽,*,楊 華

(1.浙江萬里學院生物與環境學院,浙江寧波 315100; 2.寧波市農產品加工技術重點實驗室,浙江寧波 315100; 3.寧波裕天海洋生物科技有限公司,浙江寧波 315100)

我國每年約400萬噸的低值雜魚,且隨著海洋經濟魚類資源的衰退,低值魚捕撈量呈上升趨勢,約占海域捕撈總量的57%～59%。這些低值魚用于食品加工的僅占30%左右,導致資源浪費。魚粉生產一直是開發利用低值魚蛋白的主要手段,但是我國的魚粉加工產業加工技術不完善,不僅魚粉品質普遍較差,而且環境污染較為嚴重[1-2]。魚粉加工過程中會產生大量廢棄壓榨液,每生產1噸魚粉,大約產生2～3噸壓榨液,而壓榨液的化學耗氧量和生物耗氧量高,直接排放會產生嚴重污染[3-4]。壓榨液中含有蛋白質、脂肪、微量元素等多種營養成分,具有應用潛力[5-7]。其中魚油含量隨季節、魚品種而發生變化,一般在1.5%～15%,具有開發利用價值[8]。目前,全世界食用魚油產量約30萬噸左右,而我國海洋魚油年產量約3萬噸,且近年來我國生產魚油的金槍魚等原料遭過度捕撈,資源嚴重下降[9],因此,對魚粉加工壓榨液中脂肪的開發利用,不僅可彌補魚油產原料的不足,還可提高魚粉加工副產物的綜合利用率。

海洋魚油的加工利用一直是國內外研究的熱點,也是低值魚高值化利用的主要途徑之一。海洋魚油的多不飽和脂肪酸以ω-3系列多不飽和脂肪酸中的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)最為重要,具有減少膽固醇含量、抗動脈硬化、預防阿爾茲海默癥、提升大腦機能和防止視力減退等多種生理功能[10-12]。EPA和DHA通常添加到保健食品和嬰兒食品中,高含量EPA和DHA可作為藥物用于治療高血脂、動脈硬化等心腦血管疾病[13-15]。制備高純度EPA和DHA制劑是魚油深加工的發展方向。由于魚油脂肪酸組分復雜,同時EPA和DHA又屬于熱和化學不穩定物質,很容易發生聚合、降解、氧化反應,且二者的沸點也高,這使得魚油中EPA和DHA的分離提純不易。目前,魚油中EPA和DHA的富集方法主要有尿素包合法[16-17]、有機溶劑萃取法[18]、超臨界CO2萃取法[19-20]、低溫結晶法[21]、脂肪酶濃縮法[22]、高效液相色譜法[23]以及蒸餾法[24]等。其中尿素包合法可從魚油中去除飽和及低不飽和脂肪酸從而使EPA和DHA含量升高,且操作簡便、成本低,不在高溫下進行,被廣泛應用。分子蒸餾技術具備了常規方法不可比擬的優點,受熱時間較短、分離程度較高,能極好地保證物料的天然品質而廣泛應用于天然油脂的深加工工藝中。但分子蒸餾很難去除分子量與目標組分相同的雜質,故聯合上述兩種方法可達到更顯著的效果[25-27]。從魚粉加工壓榨液中富集多不飽和脂肪酸的研究鮮見報道。魚粉加工壓榨液經離心分離或靜置分離所得毛魚油,經過精制、富集,得到富含DHA、EPA的魚油,將具有廣闊應用前景。本實驗室前期已對魚粉加工壓榨液中蛋白源進行了開發利用,在此基礎上對壓榨液中多不飽和脂肪酸進行富集,將有助于魚粉加工副產物的全值利用。因此,本文以魚粉加工壓榨液為原料,在制備得到精制魚油的基礎上,分別通過尿素包合和分子蒸餾獲得高含量的DHA和EPA,然后聯用上述兩種方法,考察DHA和EPA的富集效果,以期為魚粉加工壓榨液的高值化利用提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚粉加工壓榨液 寧波裕天海洋生物科技有限公司;混合脂肪酸甲酯標品 美國Supelco公司;無水乙醇、尿素、氫氧化鈉等 均為分析純,中國醫藥(集團)上?；瘜W試劑廠。

R-3旋轉蒸發儀 瑞士Buchi公司;5702R低溫離心機 德國Eppendorf公司;VKL70-4分子蒸餾儀 德中瑞達工藝設備(北京)有限公司;Trace1300 GC-MS儀 美國熱電公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚粉加工壓榨液中魚油的提取制備 參照李沖沖等[28]的方法,對魚粉加工壓榨液中的魚油進行提取精制。魚粉加工壓榨液采用靜置分離的方法提取魚油,在密封儲藏罐內靜置4 h后用蠕動泵吸取上層魚油。稱取所需量的魚油于燒杯中,水浴加熱攪拌至70 ℃,按1%(v/v)的添加量緩緩加入濃度為60%磷酸溶液(v/v),混合均勻后于70 ℃水浴5 min,然后4500 r·min-1離心10 min得到脫膠魚油;將脫膠魚油水浴加熱攪拌至65 ℃,按3%(v/v)的添加量緩慢加入濃度為12%的NaOH溶液(m/v),攪拌均勻,在65 ℃下加熱15 min,然后以4500 r·min-1離心10 min得到脫酸魚油;將上述脫酸魚油置于60 ℃水浴中,緩慢加入15%活性炭(m/v),不斷攪拌20 min,真空抽濾,分離出油層即為脫色魚油;將脫色魚油放入圓底燒瓶中,利用旋轉蒸發儀加熱85 ℃,在5 kPa真空度下蒸餾10 min,即得精煉魚油。精煉魚油得率(%)=精煉魚油(g)/毛魚油(g)

1.2.2 精煉魚油的乙酯化 取一定量上述精煉魚油置于圓底燒瓶中,按魚油/溶劑比2∶1 (v/v)將2 mol·L-1KOH-無水乙醇混合液分批加入到圓底燒瓶中,于75 ℃恒溫水浴;冷卻后置分液漏斗,靜置分層;然后緩慢加入2% NaCl溶液(m/v),至溶液呈中性;收集上層油相,旋轉蒸發去除油相中的乙醇和蒸餾水,得到乙酯化魚油。乙酯化魚油得率(%)=乙酯化魚油(g)/精煉魚油(g)

1.2.3 尿素包合工藝 稱取一定量尿素置于燒杯中,加入一定比例的溶劑(95%乙醇),65 ℃下使尿素溶解充分后,往尿素-乙醇飽和溶液中以一定比例緩緩加入乙酯化魚油,在65 ℃加熱至溶液變澄清,然后緩慢冷卻至室溫,密封后在低溫下包合結晶一段時間,然后4 ℃下離心(3200 r·min-1,5 min)分離,取液相旋轉蒸發去除溶劑,加少量無水硫酸鈉去水分,得到尿包魚油,并采用氣質色譜測定其脂肪酸組成及EPA和DHA含量。

EPA或DHA得率(%)=尿包魚油中EPA或DHA的質量(g)/原料魚油中EPA或DHA的質量(g)×100

1.2.3.1 尿脂比的確定 稱取15 g乙酯化魚油,以75 mL的95%乙醇為溶劑,按不同比例加入尿素,使尿素魚油質量比(m/m)分別為0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1,在0 ℃靜置結晶12 h。

1.2.3.2 溶劑用量的確定 稱取15 g乙酯化魚油、15 g尿素,以95%乙醇為溶劑,使溶劑與魚油的比例(v/m)為3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1,在0 ℃靜置結晶12 h。

1.2.3.3 結晶溫度的確定 稱取15 g乙酯化魚油、15 g尿素,以75 mL的95%乙醇為溶劑,分別在-10、-5、0、5、10 ℃的條件下包合12 h。

1.2.3.4 結晶時間的確定 稱取15 g乙酯化魚油、15 g尿素,以75 mL的95%乙醇為溶劑,在0 ℃條件下分別包合5、10、15、20、25 h。

1.2.3.5 包合次數的確定 稱取30 g乙酯化魚油、45 g尿素,在0 ℃條件下包合1、2、3次,每次包合溶劑用量與魚油用量比例為6∶1 (v/m),結晶時間為20 h。

1.2.4 分子蒸餾工藝優化 將適量乙酯化魚油加入分子蒸餾儀的進料器中,進行預熱和抽真空,系統各設定值穩定后,進行分子蒸餾,使物料以一定流速進入蒸發系統,蒸餾結束后記錄輕相和重相的重量,密封保存蒸餾產品以備分析。分別設定蒸餾溫度、刮膜器轉速、進料速率、壓力、蒸餾級數等參數,優化分子蒸餾工藝。

重相即為分子蒸餾魚油,采用氣相色譜-質譜法測定其脂肪酸組成及EPA和DHA含量。

重相回收率(%)=重相收集到魚油的質量(g)/重相收集到的魚油理論質量(g)×100

其中,理論質量(g)=原料魚油中EPA和DHA的質量(g)/重相魚油中EPA和DHA的含量。

1.2.4.1 蒸餾溫度的確定 設定預熱溫度60 ℃,進料流速2 mL·min-1,刮膜器轉速250 r·min-1,壓力5 Pa,蒸餾溫度分別為90、100、110、120、130 ℃,進行分子蒸餾,得到重相魚油。

1.2.4.2 刮膜器轉速的確定 設定預熱溫度60 ℃,進料流速2 mL·min-1,蒸餾溫度110 ℃,壓力5 Pa,刮膜器轉速分別為200、250、300、350、400 r·min-1,進行分子蒸餾,得到重相魚油。

1.2.4.3 進料速率的確定 設定預熱溫度60 ℃,刮膜器轉速250 r·min-1,蒸餾溫度110 ℃,壓力5 Pa,進料速率分別為1、2、3、4、5 mL·min-1,進行分子蒸餾,得到重相魚油。

1.2.4.4 壓力的確定 設定預熱溫度60 ℃,刮膜器轉速250 r·min-1,蒸餾溫度110 ℃,進料速率2 mL·min-1,壓力分別為2.5、5、15、25 Pa,進行分子蒸餾,得到重相魚油。

1.2.4.5 蒸餾級數的確定 設定預熱溫度60 ℃,刮膜器轉速250 r·min-1,蒸餾溫度110 ℃,進料速率2 mL·min-1,壓力5 Pa,試驗中每次分離得到的重組分重新加入進料器,進行下一級分離操作。

1.2.5 尿素包合法和分子蒸餾法的聯用 稱取一定量的乙酯化魚油,先進行一次尿素包合,得到液相中的尿包魚油,然后對尿包魚油進行2級分子蒸餾,獲得重組分,通過GC-MS分析魚油中EPA和DHA含量。

1.2.6 魚油理化指標檢測 魚油不皂化物、過氧化值、酸價、碘價、水分及揮發物等理化指標的測定參考魚油行業標準SC/T3502-2016[29]。

1.2.7 魚油中脂肪酸的檢測 樣品甲酯化參考GB 5009.168-2016[30]中酯交換法,酯化完成后,進行GC-MS分析,通過標準品比對進行定性,采用歸一化法對其定量。GC條件:色譜柱采用TG-5MS氣相毛細柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm),載氣He,不分流進樣,進樣量為1 μL,進樣口溫度250 ℃,采用升溫程序,70 ℃保持5 min,然后以每分鐘5 ℃升溫至280 ℃,保持5 min。MS條件:接口溫度250 ℃,離子源溫度210 ℃,質量掃描范圍45～450 m/z,溶劑延遲5 min。

1.3 數據統計分析

所有數據采用Microsoft Excel進行處理分析及作圖。其中,所有數據均取3次平行測量的平均值。

2 結果與分析

2.1 魚粉加工壓榨液中魚油制備及乙酯化

精煉魚油得率為45.3%,脂肪酸分析表明,精煉后魚油多不飽和脂肪酸總含量為0.69 g·mL-1,DHA和EPA含量分別為0.229和0.121 g·mL-1。在進行富集前,魚油需要進行酯化處理,以降低其極性,精煉魚油經乙酯化處理后得率為99.3%。以乙酯化魚油作為原料魚油進行后繼實驗。

2.2 尿素包合法富集魚油中EPA和DHA

由圖1A可知,隨著尿素用量的增大,液相中EPA和DHA的含量提高,二者得率則隨之降低。尿素用量過低,不能有效地包合,但其用量過高,會增加多不飽和脂肪酸與尿素的包合,反而不利于EPA和DHA的富集。實驗中當尿素與魚油比例大于1.5時,雖然液相中EPA和DHA含量增加,但其得率會大幅下降,因此,尿脂比選擇1.5∶1為宜。由圖1B可以看出,隨著溶劑用量的增加,EPA和DHA的得率逐漸增加,溶劑在尿素包合過程中起到兩相間傳質和提供反應場所的作用,較高的溶劑用量會改善兩相間傳質的效果,從而提高EPA和DHA的得率[31]。但隨著溶劑用量增加,液相中EPA和DHA的含量下降,因此綜合考慮,選取溶劑與魚油比6∶1。

圖1 尿素包合因素對液相中 EPA 和 DHA 含量及得率的影響Fig.1 Effects of urea inclusion factors on the content and yield of DHA and EPA in liquid phase 注:A:尿脂比;B:溶劑魚油比;C:結晶溫度;D:結晶時間;E:包合次數。

由圖1C可知,隨著結晶溫度的升高,液相中EPA和DHA含量逐漸降低,而其得率隨溫度的升高而增大。這是由于尿素包合物的形成是一個結晶放熱過程,低溫下更有利于包合物形成,尿素能與魚油中飽和脂肪酸形成穩定包合物,而較高的溫度會使包合物不穩定,較多的飽和脂肪酸游離到上清液中,從而使得EPA和DHA含量下降。但溫度越低,結晶生成速度越快、晶粒越小,形成的包含物表面積較大,會對EPA和DHA產生較強的包藏作用,使二者得率降低[32]。綜合考慮,結晶溫度選擇0 ℃較為合適。圖1D表明,結晶時間對包合效果影響較小,EPA和DHA的含量隨結晶時間的延長略微上升,而二者得率則隨結晶時間延長緩慢下降,綜合考慮結晶時間選擇15 h。由圖1E可知,隨著包合次數的增加，EPA和DHA的含量增大,2次包合后增大趨于平緩,而EPA和DHA的得率則隨著包合次數增加快速減小,同時包合次數增加使得試劑用量增加,因此包合次數1次為宜。

2.3 分子蒸餾法富集魚油中EPA和DHA

從圖2A中可以看出,重相產品中EPA+DHA總含量隨著蒸餾溫度的升高呈上升趨勢,其中EPA含量的增長平穩,而DHA含量上升明顯。但隨著蒸餾溫度的增加,重相回收率快速降低。這可能是由于分子平均自由程隨著溫度的增加而增大,使得重相產品中EPA和DHA的含量逐漸提高,但隨著溫度升高,部分重組分會因溫度過高而分解成輕組分被蒸出,同時重組分黏度增大,黏附在蒸發器壁面上,加速其分解成輕組分,從而降低了重組分的得率[33]。重相回收率的降低不利于工業化生產,因此選用110 ℃作為分子蒸餾的蒸餾溫度。刮膜器轉子將料液均勻涂布在蒸發器壁面上,從而達到較好的傳熱傳質效果。從圖2B可以看出,隨著刮膜器轉速的增加,EPA+DHA總含量逐漸增加,當轉速達到300 r/min后,雖然產品的EPA和DHA含量仍然是上升趨勢,但回收率大幅下降,因此刮膜器轉速選用250 r/min。

圖2 分子蒸餾因素對重相中EPA和DHA含量及回收率的影響Fig.2 Effects of molecular distillation factors on the content of EPA and DHA and the recovery in heavy phase注:A:蒸餾溫度;B:刮膜器轉速;C:進料速率;D:壓力。

進料的速度將影響料液在蒸發器壁面的停留時間,流速小,則停留時間長,物料能充分地被加熱,但重組分在蒸餾壁面的長時間停留會使部分重組分被分解為輕組分而蒸出,導致重相回收率大幅降低;而流速過大,停留時間就短,物料未及時加熱到蒸餾溫度就已經離開蒸發面,將導致產品含量低。由圖2C可知,EPA和DHA含量隨著進料速率增加而下降,而重相回收率則隨進料速率增加而上升,綜合考慮選3 mL/min作為分子蒸餾的進料速率,此時,EPA+DHA含量及重相回收率均較為合適。真空度是分子蒸餾的重要參數,當溫度一定時,物質的分子平均自由程隨壓力的降低而增加,從而使冷凝面的組分增加[33]。由圖2D可知,隨著壓力的升高,EPA+DHA含量下降,而重相回收率則大幅上升,這可能是由于壓力越小,真空度越高,輕組分越容易蒸出,使得EPA+DHA含量較高,但同時會使重組分在蒸餾壁面停留時間過長而使得其回收率大幅降低。因此,真空度不宜過高或過低,分子蒸餾的壓力選取5 Pa。

由表1可知,經一級、二級、三級分子蒸餾重組分中EPA乙酯含量變化幅度不大,而DHA乙酯含量不斷提高。經過三級分子蒸餾可得EPA和DHA總含量為63.8%,但重相回收率僅為14.10%。研究表明[24,34],對于多級分子蒸餾,壓力越低并不代表蒸餾效果越好,應根據分離要求確定經濟合理的工藝參數及操作條件。實驗結果表明二級分子蒸餾能取得較好的富集效果,且回收率較高。

表1 多級分子蒸餾對魚油脂肪酸乙酯組成的影響Table 1 Effect of multi-stage molecular distillation on the composition of fatty acid ethyl ester in fish oil

表2 富集方法對魚油理化指標的影響Table 2 Effects of enrichment methods on physicochemical properties of fish oil

2.4 魚油的理化性質分析

酯化魚油原料呈淺黃色,而富集后的產物顏色較深,呈淺棕紅色,其各項理化指標值見表2。尿素包合魚油中水分及揮發物和不溶性雜質沒有達到精制魚油一級標準(SC/T 3502-2016),說明在尿素包合過程中引入了雜質且揮發物中含有溶劑。與酯化魚油相比,富集后魚油的碘值提高較大,說明富集后魚油不飽和程度高,即EPA和DHA含量較富集前大幅提升。分子蒸餾魚油的酸值和過氧化值等理化指標較尿包魚油均有所下降,這可能是由于游離脂肪酸、水分及易揮發物質和酸敗產生的一些小分子沸點低,蒸餾過程中進入輕相中。分子蒸餾魚油的理化指標均達到了精制魚油的一級標準,而且分子蒸餾魚油在顏色、外觀和氣味等方面都得到了改善,所得魚油呈亮黃色,澄清透明無沉淀物,稍有魚油特有的腥味,無酸敗味。

2.5 魚油中主要脂肪酸分析

對魚油中主要脂肪酸進行了分析,結果如表3所示,酯化魚油中單不飽和脂肪酸主要有C16∶1、C18∶1和C22∶1,總含量為20.58%,EPA和DHA總含量為22.68%。酯化魚油經過尿素包合富集后,EPA和DHA總含量得到較大提高,含量達65.56%,而飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸主要富集到固相產物中,經檢測固相中的EPA和DHA總含量僅為3.49%。

酯化魚油經分子蒸餾富集后,C18以下的脂肪酸在重相中的含量下降,而C20以上的脂肪酸在重相中占主體,多不飽和脂肪酸的含量達到72.42%,其中EPA和DHA總含量達47.1%。而輕相中C20以上的脂肪酸含量比較低(21.04%)。這樣初步實現了將魚油分成以長碳鏈不飽和脂肪酸為主的重相和以C14、C16、C18脂肪酸為主的輕相,從而實現以EPA和DHA為主要成分的重相富集。

表3 富集方法對魚油主要脂肪酸的影響(%)Table 3 Effects of enrichment methods on composition of fatty acids in fish oil(%)

2.6 尿素包合和分子蒸餾結合工藝富集魚油中EPA和DHA

經一次尿素包合和二級分子蒸餾得到的EPA和DHA含量分別為32.20%和55.30%,二者總含量從22.68%提高到87.50%,EPA+DHA得率為42.02%,且EPA/DHA為0.58。

3 討論

飽和及低不飽和脂肪酸可與尿素形成穩定的包合物,并在低溫下結晶析出,DHA與EPA等多不飽和脂肪酸不易被尿素包合而留在液相中,尿素包合已被廣泛用于油脂中多不飽和脂肪酸的富集,由于其所需設備簡單,試劑便宜,操作簡便,能較好地保留富集物的功能活性,尿素包合已成為一種大規模的、有效的預分離方法。此外,考慮到試劑安全性和包合成本,實驗采用乙醇作為尿素包合溶劑。實驗表明,魚粉加工壓榨液精煉魚油經尿素包合后,EPA和DHA總含量得到大大提升,達到65.56%,達到保健魚油含量要求,且酸值、碘值、過氧化值等均符合精制魚油一級標準(SC/T 3502-2016);經過二級分子蒸餾后,EPA和DHA總含量(48.3%)低于尿素包合制備所得魚油,但經三級分子蒸餾后得到的魚油中EPA和DHA總含量達到63.81%,與尿素包合魚油相當;尿素包合與二級分子蒸餾聯用后,可使EPA和DHA總含量提高至87.50%。EPA和DHA總含量達到28%的魚油稱為多烯魚油,具有降血脂和健腦等保健功能,中國藥典規定當多烯魚油中EPA與DHA的總含量大于84%,且EPA/DHA為0.4～1時可做為降脂藥物[35]。高含量EPA和DHA的多烯酸乙酯藥品的臨床試驗已顯示出明顯的療效。尿素包合和分子蒸餾聯用制得魚油中EPA和DHA含量分別為32.2%和55.3%,EPA/DHA約為0.58,達到多烯酸乙酯的要求,具有作為降脂藥物的應用潛力,市場前景廣闊。富集后的魚油具有高度不飽和性,對外界環境(如氧、光、熱等)極為敏感,易發生氧化裂變,從而影響其功能性,因此,在制備富含ω-3多不飽和脂肪酸魚油的基礎上,后期應系統開展魚油的穩態化研究,制備穩定性及加工適應性良好的產品,優化其工藝。

4 結論

以魚粉加工壓榨液為原料,采用尿素包合和分子蒸餾的方法富集其EPA和DHA,優化的工藝參數為:以尿素/魚油1.5∶1 (m/m)、溶劑/魚油6∶1 (v/m)、0 ℃條件下結晶15 h,進行尿素包合;包合后,以蒸餾溫度110 ℃、刮膜器轉速250 r·min-1、進料速率3 mL·min-1、壓力5 Pa條件下進行二級分子蒸餾;通過上述兩個處理過程,EPA和DHA含量由22.68%提高到87.50%,得率42.02%,且EPA/DHA約為0.58。本實驗可有效地從魚粉加工壓榨液中制備高EPA和DHA含量的魚油,從而大大提高魚粉加工副產物的附加值。