微波強化殼聚糖固相酸降解研究

許 磊,焦思明,張文昌,程 功,孫家言,趙 巖,*,張勁松,*

(1.中國科學院金屬研究所沈陽材料科學國家研究中心,遼寧沈陽 110016; 2.中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室,北京 100190)

低分子量殼聚糖(low molecular weight chitosan)和殼寡糖(chitooligosaccharides,COS)是一類具有抗菌[1-2]、調節免疫[3-4]、抗腫瘤[5-6]、誘導植物抗病抗逆與促進植物生長[7-8]等多種生物活性的生物材料[9-11],通常由殼聚糖(chitosan,CS)降解制備,具有良好的應用前景。目前較低的生產效率和制備成本限制了它們的廣泛應用。殼聚糖的降解通常包括氧化降解、酶降解和酸降解等方法[12-13]。殼聚糖氧化降解中較為常用的氧化劑是過氧化氫[14-15],但其降解產物的糖單元的結構會發生變化[16]。酶降解是一種較為常用的殼聚糖降解方法,通常將殼聚糖用稀酸溶解后添加適量的酶進行降解反應[17-19]。殼聚糖本身是一種高分子,溶解后會產生一定的粘度,其粘度隨著濃度的增大而增大。當殼聚糖溶液粘度過大時,酶降解難以順利進行,因此酶降解反應殼聚糖底物的濃度通常為2.0%(2.5%左右,限制了殼寡糖單位時間內的產能。

酸降解也是一種較為常用的殼聚糖降解方法,一般是將殼聚糖用稀酸溶解后,以“勻相”的方式進行降解[20-21],目前存在收率低,反應時間長和廢液排放等問題。Osorio-Madrazo研究了殼聚糖在固相條件下進行酸降解[22-23],與殼聚糖“勻相”酸降解相比,固相酸降解具有反應時間短、后處理簡單、降低廢液排放等優點,但由于常規加熱方法難以實現對固相反應體系的快速均勻加熱,使得殼聚糖的固相降解反應過程難以控制。

微波是一種電磁波,可以實現對材料的選擇性加熱,強化化學反應過程,大幅提高反應速率。微波降解殼聚糖已有研究,Jaroslaw認為微波提高降解反應速率的機理是微波引起分子振蕩產生剪切力導致聚合物主鏈斷裂[24],Chen和Xing在研究殼聚糖微波降解時使用離子液體[25]、無機鹽[26]等作為添加劑,他們認為微波提高降解反應速率的機理是微波與添加劑的相互作用產生過熱效應。微波加熱酶降解殼聚糖制備殼寡糖的研究[27-28]也有相關報道。這些方法均是以“勻相”方式進行,殼聚糖在微波強化下的固相酸降解還未有報道。

針對常規加熱方法殼聚糖固相酸降解過程中物料難以快速均勻加熱的問題,本文研究了微波強化下的殼聚糖固相酸降解反應。利用微波對材料的選擇性加熱特點,開發出一種高效制備低分子量殼聚糖和殼寡糖的方法,有助于低分子量殼聚糖和殼寡糖的廣泛應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖 脫乙酰度=85%,揚州日興生物科技有限公司;殼聚糖酶APCSN(酶活力:2500 U/g) 中國科學院過程工程研究所提供;系列分子量右旋糖酐(峰位分子量Mp=180、9750、36800、135350、300600、2000000) 中國食品藥品檢定研究所;其他試劑 均為AR級。

微波反應器 實驗室自制,其示意圖見圖1,反應釜外壁為不銹鋼,內襯為聚四氟乙烯,微波發射頻率為2450 Hz;LC-20A高效液相色譜儀(配有LC-20AT恒流泵、CTO-20A柱溫箱、RID-10A示差檢測器) 日本Shimadzu公司;Agilent Technologies Cary 630 spectrometer傅立葉變換紅外光譜儀 美國Agilent公司;Bruker 600 MHz UltraShieldTM核磁共振儀 瑞士Bruker公司;TSQ Quantum Access Max質譜儀 美國Thermo Scientific公司;NDG-5型數顯粘度計 上海順宇恒平科學儀器有限公司。

圖1 微波反應器示意圖Fig.1 Schematic diagram of microwave reactor

1.2 實驗方法

1.2.1 反應參數對微波強化殼聚糖固相酸降解的影響

1.2.1.1 微波輻射功率 稱取30 g殼聚糖置于微波反應器的反應釜中,緩慢加入15 mL 12 mol/L鹽酸,攪拌均勻后物料用微波加熱。微波輻射功率分別為10、20、30、40、50 W,輻照時間為4 min。反應結束后,物料用無水乙醇洗滌兩次,4000 r/min離心5 min,60 ℃真空干燥24 h,得到降解產物(總共5組反應,得到5份降解產物,分別編號為W10、W20、W30、W40、W50)。

1.2.1.2 鹽酸用量 稱取30 g殼聚糖置于微波反應器反應釜中,緩慢加入不同劑量的12 mol/L鹽酸(分別為12、15、18 mL,即殼聚糖/鹽酸的質量體積比為5∶2、2∶1、5∶3),攪拌均勻后物料用微波加熱。微波輻射功率為20 W,輻射時間依次為4、7、10、15、20 min。反應結束后,物料用無水乙醇洗滌兩次,4000 r/min離心5 min,60 ℃真空干燥24 h,得到降解產物(總共15組反應,得到15份降解產物,分別編號為CS12-4～CS12-20、CS15-4～CS15-20、CS18-4～CS18-20)。

1.2.2 降解產物的GPC(凝膠滲透色譜)分析 稱取上述制備的降解產物各10 mg,用1 mL 0.1 moL/L的乙酸/乙酸鈉緩沖溶液溶解,配成10 mg/mL的溶液,用GPC分析分子量數據。GPC的色譜條件為:A6000M色譜柱(300 mm×8.0 mm,Viscotek),柱溫30 ℃,流動相為0.1 moL/L的乙酸/乙酸鈉緩沖溶液,流速0.5 mL/min,進樣量20 μL,標定色譜柱分子量的標準品是系列分子量的右旋糖酐。

1.2.3 降解產物的FTIR(傅立葉變換紅外光譜)和1H NMR(核磁共振氫譜)分析 稱取上述制備的部分降解產物(CS15-4～CS15-20)與干燥的KBr以1∶100的質量比混合,壓片后進行FTIR分析。FTIR波數范圍為400～4000 cm-1,分辨率為4 cm-1,在透射模式下累積128次掃描。另取上述制備的部分降解產物(CS15-4～CS15-20)各30 mg,加入0.5 mL D2O溶解,進行1H NMR分析。

1.2.4 降解產物的粘度系數測定 稱取上述制備的部分降解產物(CS15-4～CS15-20)各5 g,配制成濃度為10%的水溶液,用轉子粘度計在室溫下測定粘度系數。

1.2.5 微波強化殼聚糖固相酸降解和酶降解復合制備殼寡糖 按照上述優化得到的最優參數制備殼寡糖,即稱取30 g殼聚糖,置于微波反應器的反應釜中,然后緩慢加入15 mL 12 mol/L的鹽酸,充分攪拌混合后,微波加熱,微波功率20 W,微波輻射時間20 min。反應結束后,取出物料加入蒸餾水配置成濃度約為10%的溶液,加入一定量的殼聚糖原料調節溶液的pH至5.0左右。最后溶液中加入300 mg的殼聚糖酶APCSN,42 ℃酶降解24 h,4000 r/min離心5 min,清液部分冷凍干燥,得到殼寡糖。

1.2.6 殼寡糖的MS(質譜)和1H NMR分析 稱取殼寡糖凍干樣品10 mg,使用超純水配制成0.2 mg/mL溶液,使用MS直接進樣檢測。質譜檢測條件為:ESI 源,正離子掃描模式,毛細管電壓為3 kV,錐孔電壓為60 V,離子源溫度為150 ℃,脫溶劑氣的溫度為500 ℃,錐孔氣流量為50 L/h,脫溶劑氣流量為800 L/h,碰撞能量為30～60 V,離子能量為3 V。另取殼寡糖凍干樣品30 mg,加入0.5 mL D2O溶解,進行1H NMR測試。

1.3 數據處理

GPC采用LC-solution軟件處理數據,MS采用Thermo TSQ Quantum軟件處理數據,Origin 6.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 反應參數對微波強化殼聚糖固相酸降解的影響

2.1.1 微波輻射功率 首先研究微波輻射功率對微波強化殼聚糖固相酸降解的影響,表1給出了不同微波輻射功率降解產物的GPC數據(Mn和Mw分別表示數均分子量和重均分子量)。根據GPC分析可知,微波功率越大,其降解產物的分子量越小,即殼聚糖的降解反應、速率隨微波功率的增加而加快,其原因在于體系溫度是決定降解反應速率的主要因素之一。微波功率越大,體系升溫越快,殼聚糖的降解速率越快，當微波功率為20 W時,殼聚糖的降解速率適中,因此固定微波功率為20 W。

表1 不同微波輻射功率降解產物的GPC數據Table 1 GPC analysis of degraded products by microwave irradiation with different power

2.1.2 鹽酸用量 繼續研究鹽酸用量對微波強化殼聚糖固相酸降解的影響。表2給出了不同鹽酸用量制備的降解產物的GPC數據。圖2為殼聚糖(CS)和部分降解產物的GPC洗脫曲線,與殼聚糖CS相比,降解產物CS12-10、CS15-10和CS18-10的保留時間(Retention time)均有所加長,說明降解反應進行10 min后,降解產物的平均分子量均已降低,其中降解產物CS15-10和CS18-10的平均分子量降低更為明顯。圖3為不同鹽酸用量制備的降解產物的Mw的變化曲線,說明隨著降解反應的進行,降解產物的分子量逐漸下降,鹽酸用量為12 mL的殼聚糖降解速率相對較慢,而鹽酸用量為15和18 mL的殼聚糖降解速率相對更快。

表2 不同鹽酸用量降解產物的GPC數據Table 2 GPC analysis of degraded products by microwave irradiation with dosage of hydrochloric acid

圖2 殼聚糖(CS)和降解產物(CS12-10、 CS15-10、CS18-10)的GPC洗脫曲線Fig.2 GPC elution curve of chitosan(CS)and degraded products(CS12-10,CS15-10,CS18-10)

圖3 不同鹽酸用量降解產物的Mw的變化曲線Fig.3 Change curve of MW of degraded products with dosage of hydrochloric acid

殼聚糖酸降解反應,除了體系溫度,[H]+的濃度也是決定降解反應速率的主要因素之一。微波強化殼聚糖固相酸降解過程中,殼聚糖首先與鹽酸進行成鹽反應生成鹽酸鹽,消耗一定量的[H]+,剩余的[H]+則作為催化劑參與反應,其濃度越高,殼聚糖降解速率越快。GPC數據分析、圖2和圖3表明,鹽酸用量為12 mL的殼聚糖降解速率相對較慢,其主要原因是大部分[H]+與殼聚糖反應生成鹽酸鹽,起催化作用的[H]+濃度相對較低。鹽酸用量為15和18 mL的殼聚糖降解速率較快,主要原因是起催化作用的[H]+濃度相對較高,經微波輻射15 min以上,其降解產物(CS15-15、CS15-20、CS18-15、CS18-20)的重均分子量均小于50000,已達到低分子量殼聚糖的水平。在微波強化殼聚糖固相酸降解反應能夠順利進行的基礎上,從環保方面考慮應降低鹽酸的使用量,因此最佳降解工藝的鹽酸用量為15 mL,即殼聚糖/鹽酸的質量體積比為2∶1。

2.2 微波強化殼聚糖固相酸降解產物的結構分析

殼聚糖(CS)和降解產物(CS15-4～CS15-20)的FTIR光譜見圖4。FTIR光譜表明,微波強化殼聚糖固相酸降解反應過程中,殼聚糖在不同的降解時間內其結構沒有明顯變化。隨著降解反應的進行,A1150/A1050(A1150和A1050分別代表樣品在FTIR光譜中波數為1150和1050 cm-1對應的吸收度,A1150/A1050即兩者的比值)數值不斷降低,表明殼聚糖單體間的糖苷鍵在酸降解過程中不斷減少[29]。

降解產物(CS15-4～CS15-20)的脫乙酰度用1H NMR法測定[30],數據見表3。通過分析可知,與殼聚糖原料相比,降解產物的脫乙酰度略有增加,說明微波強化固相酸降解反應中,殼聚糖上的N-乙酰氨基會發生少量的脫乙酰反應。

經FTIR和1H NMR分析,表明微波強化殼聚糖固相酸降解反應中,殼聚糖沿主鏈隨機降解,N-乙酰氨基會發生少量的脫乙酰反應,除此之外未觀察到其它結構變化。殼聚糖微波固相酸降解過程中,由于殼聚糖能與鹽酸進行成鹽反應,因此降解產物主要以鹽酸鹽的形式存在,具有良好的水溶性。

2.3 微波強化殼聚糖固相酸降解和酶降解復合制備殼寡糖

經過上述的相關研究可知,采用微波強化固相酸降解的方法,殼聚糖可在短時間內快速均勻降解,得到重均分子量低于50000且具有良好水溶性的低分子量殼聚糖。但是,當繼續加大鹽酸用量或延長反應時間,制備平均分子量更低的殼聚糖(重均分子量低于10000)或殼寡糖時,產品的收率就會明顯下降且狀態變差,其主要原因在于酸降解過程中糖苷鍵的斷裂是隨機發生的,隨著降解反應的進行會不斷地產生大量的單糖,而單糖在酸性的條件下會發生多種副反應導致產品狀態差和收率降低,甚至生成毒性物質[31]。

殼聚糖經微波強化固相酸降解處理后,由于其平均分子量已明顯降低,溶解后的粘度也將大幅降低。降解產物(CS15-4(CS15-20)的粘度系數數據見表4。根據表4可知,降解產物CS15-10、CS15-15和CS15-20的溶液濃度為10%時,其粘度系數均低于殼聚糖原料(濃度2.5%)。使用經微波強化固相酸降解處理后的低分子量殼聚糖作為酶降解的底物,底物的濃度可大幅提高,從而提高酶降解制備殼寡糖單位時間內的產能。因此,當降解目標產物是重均分子量低于10000的殼聚糖(例如殼寡糖)時,可先采用微波固相強化酸降解制備低分子量殼聚糖(重均分子量10000～50000),然后得到的低分子量殼聚糖再用酶降解制備殼寡糖。這種復合降解方法即能避免酸降解收率低狀態差的問題,又可改善酶降解的制備效率,提高殼寡糖單位時間內的產能。

表4 殼聚糖和降解產物的粘度系數Table 4 Viscosity coefficient of chitosan and degraded products

考慮到整個方法的連續性和便捷性,復合降解最佳工藝為微波強化固相酸降解反應完成后,得到的低分子量殼聚糖直接溶解進行酶降解,即物料不經過醇洗、干燥等處理過程。由于微波固相酸降解中[H]+是過量的,因此溶解后溶液的pH可能會過低,影響酶解的效率,可通過添加適量的殼聚糖原料來調節溶液的pH至酶降解適合的區間(殼聚糖酶APCSN為4.2～6.0),從而使酶降解反應順利進行。

以降解產物CS15-20(降解產物CS15-10,CS15-15經調節pH處理后,其粘度系數均大于972.5 cm·g·s)的微波強化固相酸降解反應條件,研究微波強化固相酸降解和酶降解復合制備殼寡糖。微波強化殼聚糖固相酸降解反應結束后,取出物料直接加入蒸餾水配置成濃度約為10%的溶液,測定溶液的pH為1.4左右。向溶液中添加殼聚糖原料(約4.5 g),待其完全溶解后溶液,測定溶液的pH為5.0左右(處于殼聚糖酶APCSN降解的適合區間),此時溶液的粘度系數為524 cm·g·s(仍低于2.5%的殼聚糖溶液,說明在粘度上酶降解反應可以順利進行)。最后添加殼聚糖酶APCSN進行酶降解反應,得到殼寡糖COS。這種復合降解最后酶降解時殼聚糖底物的濃度可達11.5%,是目前酶降解法制備殼寡糖生產工藝中殼聚糖底物濃度(2.0%～2.5%)的4倍以上,即殼寡糖單位時間內的產能可提高4倍以上。

最后用MS和1H NMR對制備的殼寡糖COS的結構進行了分析。

MS檢測(圖5)及分析結果顯示,殼寡糖COS的主要成分為全脫乙酰的殼二糖至殼五糖,此外還含有少量的含乙?；臍す烟墙M分。圖6為殼寡糖COS的1H NMR譜圖,為典型的殼寡糖1H NMR譜圖,殼寡糖的脫乙酰度為88%。

圖5 殼寡糖COS的MS分析 Fig.5 Mass spectrometry analysis of chitooligosaccharides COS

圖6 殼寡糖COS的1H-NMRFig.6 1H-NMR of chitooligosaccharides COS

MS和1H NMR的分析表明,殼寡糖COS的主要組成成分與殼聚糖直接酶降解制備的殼寡糖(中國科學院過程工程研究所提供,殼聚糖用稀鹽酸溶解后酶降解,濃度為2.5%,酶的種類和反應條件與本文完全相同)的結構基本完全一致,說明微波強化固相酸降解和酶降解復合制備殼寡糖完全具有可行性,可以顯著提高殼寡糖單位時間內的產能。

3 結論

本研究建立了一種基于微波強化固相酸降解的高效制備低分子量殼聚糖的方法。利用微波對酸化物料的選擇性加熱特點,有效解決了常規加熱方式殼聚糖固相酸降解過程中物料的快速均勻加熱難題。殼聚糖固相酸化物料可在微波作用下短時間內快速均勻降解,高效制備重均分子量在10000～50000的低分子量殼聚糖,且糖單元的結構在反應過程中保持穩定。當降解目標產物重均分子量低于10000時(例如殼寡糖),微波強化固相酸降解仍無法解決傳統殼聚糖酸降解收率低、狀態差的問題。針對此問題本研究提出采用微波強化殼聚糖固相酸降解和酶降解復合工藝,該工藝操作簡便,可有效解決殼聚糖酸降解收率低和酶降解效率低的問題,殼寡糖單位時間內的產能可提高4倍以上。

本研究制備的低分子量殼聚糖和殼寡糖以鹽酸鹽的形式存在,其在功能和生物活性方面與傳統殼聚糖酶降解制備的產品(多為醋酸鹽)是否存在差異,還需進一步研究。