九蒸九制對黃精多糖單糖組成及其抗氧化性的影響

吳豐鵬,李芹英,*,吳彥超,李惠靜,*

(1.哈爾濱工業大學(威海)海洋科學與技術學院,山東威海 264209; 2.威海海洋生物醫藥產業技術研究院,山東威海 264400)

黃精(Polygonatumsibirieum)是藥食同源多年生的草本植物,根據其根莖的形狀不同習慣分為“雞頭黃精”、“姜形黃精”、“大黃精”。黃精屬于百合科黃精屬(PolygonatumMill.),目前全球共有黃精屬植物327種,我國共有79種[1]。作為中藥材,黃精味甘性平,歸脾、肺、腎經,具有健脾、潤肺、益腎以及補氣養陰等功能[2],可用來治療肺虛燥熱、脾胃不和、體倦乏力、精血不足等癥狀,世人將黃精譽為“血氣雙補之王”[3]。黃精中含有多種多樣的化學成分,含量最多的是多糖,約為14%左右,另外還有皂苷、氨基酸、木質素、甾醇、黃酮、揮發油等重要的化學成分[4]?，F代藥理學對藥用黃精的研究表明,黃精具有降血糖、降血脂[5]、抗炎[6]、抗病毒[7]、抗菌、抗腫瘤[8-9]、美容養顏、提高記憶力[10]、改善免疫力[11]等功效,具有較高的藥用價值及良好的市場前景。

近年來,中醫治療技術得到了空前的發展,受到了越來越多人的青睞與重視[12]。中藥炮制品的制作主要是將生藥材進行浸泡、蒸制、蜜制等過程,是我國傳統中醫的特色[13],數千年來用于身體的保健與疾病的治療。九蒸九制作為一種傳統的炮制中藥方法,一般用來炮制比較珍貴的藥材,如黃精、地黃、何首烏等大宗藥材,黃精未炮制前往往對人體具有刺激性和毒害副作用,經炮制后消除了這些刺激性和毒害作用,還使其藥物成分和藥性得到改善,補益作用大大增強[14]。黃精炮制后其化學成分和藥理活性會發生不同程度的變化[15],而多糖是黃精中最主要的藥用成分,研究證明黃精多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等藥理功效,炮制后多糖變化的具體研究尚不明確,因此,本文探究了黃精在九蒸九制炮制過程中多糖的含量及單糖組成變化,并對炮制過程中多糖的體外抗氧化活性進行測定,以期發現黃精多糖最佳的炮制工藝,為臨床用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃精 取自于山東威海2年生的雞頭黃精塊莖;葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)、水楊酸(VC) 上海源葉生物科技有限公司;2,2-聯苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2,2′-聯氨-雙(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS) 上海麥克林生化科技有限公司;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP) 薩恩化學技術有限公司;磷酸二氫鉀、過硫酸鉀、氫氧化鈉、濃硫酸、鹽酸、三氟乙酸(TFA)、苯酚、乙醇 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;三氯甲烷、正丁醇、甲醇、乙腈 色譜純,Fisher Scientific。

DZF6020型電熱恒溫鼓風干燥箱 江南寧波制造廠;HHS-11-2型恒溫水浴鍋 上海博訊實業有限公司;LGJ-10E型真空冷凍干燥機、DL-5-B型離心機 上海安亭科學儀器廠;旋轉蒸發儀 東京理化器械株式會社;UV-1800紫外可見分光光度計 島津儀器有限公司;SCL-10AVP型高效液相色譜儀 島津制作所;氮吹儀供氮機 杭州德克爾實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃精多糖的制備 黃精塊莖去除須根后清洗曬干,從生片開始,對黃精塊莖進行清水蒸制(121 ℃,0.12 MPa,60 min),每蒸制一次后放入45 ℃烘箱至重量不再減少,留樣,重復九次[16],隨后進行切片、打磨成粉末并過20目篩。稱取0～9次蒸制黃精粉末30 g,分別用80%的乙醇進行脫脂處理及揮干乙醇后,在料液比為1∶20、溫度為60 ℃的條件下,用雙蒸水提取3 h,重復浸提3次,旋蒸濃縮,5倍體積的無水乙醇4 ℃靜置沉淀過夜,離心干燥即得黃精粗多糖。隨后采用Sevag法對粗多糖進行蛋白質脫除[17],重復5～6次去除蛋白質,40 ℃旋蒸去除殘留的有機溶劑,凍干,即得精制黃精多糖,根據蒸制次數將其分別命名為PSP0～PSP9。

1.2.2 多糖含量的測定

1.2.2.1 標準品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標準品30.70 mg,置于100 mL的容量瓶中,加去離子水溶解并定容至100 mL,反復搖勻,可得0.307 mg/mL的葡萄糖標準品溶液。

1.2.2.2 標準曲線的繪制 精密量取葡萄糖標準品溶液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL,分別置于干凈試管中,并分別加去離子水至2 mL,各取100 μL于具塞試管中,依次加入新配置的6%苯酚溶液200 μL、濃硫酸溶液1 mL,搖勻后,在100 ℃水浴10 min,冷卻,以去離子水為空白溶劑同法操作作為空白對照,在489 nm處測定吸光度,以葡萄糖質量濃度(X)為橫坐標,吸光度(Y)為縱坐標繪制標準曲線,得標準曲線為:Y=0.0241X-0.0082,R2=0.9992。

1.2.2.3 供試品溶液的制備 分別精密稱取干燥至恒重的0～9次蒸制黃精樣品粉末1 g,按照“1.2.1”的方法進行黃精多糖的提取,再移至50 mL容量瓶中,用去離子水定容至刻度,即得供試品溶液。

1.2.2.4 黃精九蒸九制過程中多糖含量的測定 準確量取0.50 mL的各供試品溶液于干凈具塞試管中,按照“1.2.2.2”的方法測定各供試品的吸光度(Y),代入標準曲線回歸方程可計算多糖的質量濃度,然后再計算出黃精多糖的含量。

1.2.3 黃精多糖中單糖組成分析

1.2.3.1 單糖標準品的衍生化 準確稱取標準品Glc、Man、Rha、GlcA、GalA、Gal、Ara各5 mg,各自配成5 mg/mL的水溶液待用。準確吸取如上配好的各標準單糖溶液10 μL于EP管中,并加水至100 μL,隨后按順序加入100 μL 0.30 mol/L的NaOH溶液,120 μL 0.50 mol/L的PMP-甲醇溶液,密封好后于70 ℃水浴鍋中水浴1 h,冷卻,再加入100 μL 0.30 mol/L的HCl中和至中性。加入500 μL三氯甲烷,漩渦振蕩,使三氯甲烷與樣品完全混合,再離心10 min,要上層水相,用注射器吸走下層,連續操作3次后上層水相用注射器吸取并過0.22 μm的濾膜,即得衍生化后的混標[18]。

1.2.3.2 黃精多糖的衍生化 準確稱取0～9次蒸制黃精精制多糖5 mg,各自配成5 mg/mL的水溶液待用。吸取各多糖溶液200 μL于安瓿瓶中,分別加入4 mol/L的TFA溶液200 μL,用酒精噴燈封瓶,于110 ℃烘箱中水解4 h。水解完后,用氮吹儀吹干,再加入200 μL的甲醇溶液繼續吹干,重復三次直至無TFA刺激性氣味。隨后加入150 μL的水溶解,吸取100 μL于EP管中,同“1.2.3.1”方法進行衍生化。

1.2.3.3 色譜條件 色譜柱:Inertsil ODS-3 C18,250×4.6 mm,5 μm,流動相為0.10 mol/L的磷酸鹽緩沖液-乙腈(83∶17,pH=7.0),流速1 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長245 nm,進樣量5 μL,檢測時間40 min。

1.2.4 多糖的體外抗氧化活性測定

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力的測定 取DPPH試劑,用乙醇配制成0.40 mmol/L的DPPH工作液待用。將多糖樣品配制成2、4、6、8、10 mg/mL不同濃度的多糖溶液,分別吸取0.50 mL于具塞試管中,再依次加入0.30 mL的DPPH工作液和2 mL的去離子水,同時設置對照和背景,置于黑暗處反應30 min,每組樣品設置三組平行,并以相同濃度梯度的VC為陽性對照[19]。反應結束后,用紫外-可見分光光度計測定其在517 nm處的吸光度。DPPH清除率按該方程式計算:

C(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:C為清除率;A0為對照吸光度(0.50 mL水+0.30 mL DPPH工作液+2 mL水);A1為樣品吸光度(0.50 mL樣品+0.30 mL DPPH工作液+2 mL水);A2為背景吸光度(0.50 mL樣品+0.30 mL水+2 mL水)。

1.2.4.2 ABTS陽離子自由基清除能力的測定 將7 mmol/L的ABTS水溶液與2.45 mmol/L的過硫酸鉀水溶液按1∶1的比例混合,于黑暗處靜置12 h,之后加水稀釋,使其在734 nm處的紫外-可見分光光度計測得的吸光度值為0.7±0.05,即ABTS工作液配制完成。將多糖樣品配制成2、4、6、8、10 mg/mL不同濃度的多糖溶液,分別吸取0.15 mL于具塞試管中,再加入3 mL的ABTS工作液,同時設置對照和背景,置于黑暗處反應6 min,每組樣品設置三組平行,并以相同濃度梯度的VC為陽性對照[20]。反應結束后,用紫外-可見分光光度計測定其在734 nm處的吸光度。ABTS清除率按該方程式計算:

C(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:C為清除率;A0為對照吸光度(0.15 mL水+3 mL ABTS工作液);A1為樣品吸光度(0.15 mL樣品+3 mL ABTS工作液);A2為背景吸光度(0.15 mL樣品+3 mL水)。

1.3 數據處理

選用Excel 2010、SPSS 25.0進行數據處理,以及t檢驗顯著性分析,并通過Graphpad prism 7.0軟件計算黃精多糖樣品DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力的半抑制濃度IC50值。

2 結果與分析

2.1 多糖含量的測定

根據葡萄糖標準曲線Y=0.0241X-0.0082,R2=0.9992,計算黃精多糖含量,結果如圖1所示。從圖1可看出,未蒸制時黃精多糖含量最高,達到14.36%,隨著蒸制次數的增加,多糖含量逐漸減少,從第3次蒸制開始,多糖的含量趨于穩定,保持在4%左右,與陳瑞瑞等[21]的結果一致。黃精經過蒸制后,顏色逐漸加深,麻舌感逐漸消失,甜味增強,說明蒸制過程減弱了對人體的刺激性和毒害作用,并使口感變佳。但多糖的含量顯著減少,這是由于在蒸制過程中,持續高溫環境下多糖大量水解成單糖和低聚糖,從而導致蒸制后多糖含量減少。

圖1 0～9次蒸制黃精的多糖含量變化Fig.1 Polysaccharide content Changes of Polygonatum sibiricum steamed for 0～9 times

2.2 黃精多糖中單糖組成

圖2 酸降解后黃精多糖樣品的單糖組成HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of monosaccharide composition of PSPs after acidic hydrolysis注:Std為單糖混標,PSP0～PSP9為 0～9次蒸制次數的黃精多糖。

采用PMP衍生化-HPLC法檢測0～9次炮制后黃精精制多糖的單糖組成,單糖PMP衍生化后,可以使其帶上發色基團,具有紫外吸收,從而可以用紫外檢測器對單糖進行定性定量分析[22]。檢測結果如圖2和表1所示。通過與混合單糖標準品色譜圖對比,以及出峰時間、峰面積的大小,可以判斷未蒸制黃精的多糖其單糖組成為Man、Glc、Gal、Ara,4種單糖的百分含量為52.47%、36.84%、7.32%、3.37%;蒸制后黃精多糖的單糖組成有所變化,隨著蒸制次數的增加,Man的含量不斷降低,從最初的52.4%減少至第九次蒸制時的18.86%;Glc的含量在前兩次蒸制中降低,但隨著蒸制次數的增加其含量又不斷增加,最高為第九次蒸制時的52.2%;Gal和Ara隨著蒸制次數的增加,其含量相對增加,其中Gal含量增加的量相對比較大。多糖在常溫條件下是比較穩定的,而在蒸制過程高濕度和高溫的條件下,各種糖類成分可發生脫水反應和降解反應,并且在其他成分如氨基酸的共同存在下會發生Maillard反應[23],多糖由各種單糖構成,其在炮制的過程中發生降解,進而發生其他反應變化,改變了多糖的單糖組成。

表1 九蒸九制黃精多糖的單糖組成分析Table 1 Monosaccharide composition of PSPs after nine-steam-nine-bask processing

2.3 多糖的體外抗氧化活性

DPPH是一種很穩定的自由基,顏色為紫色,它可用于測定各種抗氧化劑清除自由基的能力大小,抗氧化劑通過轉移電子或傳遞氫原子給DPPH，從而中和自身的自由基,所以可以從對DPPH自由基的清除能力來反映抗氧化劑的供氫能力[24]。ABTS作為一種比較穩定的自由基,呈藍綠色,它可以與抗氧化劑結合發生顏色變化,可以通過顏色變化的程度在特定的波長下測定其吸光度值來評價抗氧化劑對ABTS陽離子自由基的清除能力[25]。如圖3、圖4所示,黃精多糖呈現出一定的抗氧化活性。從圖3中可以看出,黃精多糖對DPPH自由基有較強的清除能力,隨著多糖濃度的提高其清除能力隨之提高,說明清除能力與多糖濃度呈劑量依賴性;黃精多糖對ABTS陽離子自由基清除的能力要比清除DPPH自由基的能力略高,并與多糖的濃度呈相關性,但黃精多糖的清除能力均低于VC的清除能力;經蒸制后的黃精,其多糖對自由基的清除能力明顯高于未蒸制黃精(P<0.05),但蒸制次數對黃精多糖抗氧化活性影響不大,只是隨著蒸制次數的增加,抗氧化能力略微有所增加,如多糖濃度在10 mg/mL時,未蒸制黃精的多糖對DPPH和ABTS的平均清除能力分別為53.89%和58.63%,蒸制1～9次時多糖對DPPH和ABTS的平均清除能力分別為在60.35%～67.86%、63.32%～69.74%之間。通過Graphpad prism7.0軟件計算黃精多糖樣品對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力的半抑制濃度IC50值,如表2所示,未蒸制黃精的多糖對DPPH和ABTS平均清除能力的IC50值分別為8.71和7.53 mg/mL,經蒸制后的黃精多糖對自由基平均清除能力的IC50值均低于未蒸制時黃精多糖的,說明蒸制后的黃精多糖抗氧化性更強。

圖3 多糖對DPPH羥基自由基清除率Fig.3 Scavenging rate of DPPH radicals by PSPs注:PSP0～PSP9為0～9次蒸制次數的黃精多糖。圖4同。

圖4 多糖對ABTS陽離子自由基清除率Fig.4 Scavenging rate of ABTS cationic free radicals by PSPs

表2 九蒸九制黃精多糖的抗氧化活性Table 2 The antioxidant activity of polysaccharide in Polygonatum sibirieum

3 結論與討論

黃精入藥前往往經過炮制處理,炮制既可除去其刺激性,也方便保存,炮制前后其化學成分會發生不同程度的變化[26]。本研究采用苯酚-濃硫酸法測定蒸制過程中黃精多糖含量的變化,得出黃精在蒸制過程中,隨著蒸制次數的增加,多糖含量逐漸減少,從最初的14.36%下降到4%左右,到蒸制第3次時,黃精的多糖含量趨于穩定并保持在4%左右;古法炮制講究九蒸九制,但從多糖含量的變化來看,蒸制3次與蒸制9次已無多大差別,后續的改變可能傾向于口感的變佳和其他藥效成分的增強,但究竟蒸制3次與蒸制9次的黃精藥用效果是否一致,則需要進行進一步的研究。

采用水提醇沉法制備炮制黃精的多糖,并對每次蒸制后提取的多糖進行單糖組成分析測定,未蒸制黃精的多糖中主要由Man、Glc、Gal、Ara這4種單糖組成,其中Man含量最多,達到52.47%,其次是Glc,含量為36.84%,Gal的含量較低,為7.32%,Ara含量最低,含量為3.37%;通過蒸制后,Man含量減少,Glc含量先減少后增多,Gal和Ara含量增加,說明蒸制過程對黃精多糖的單糖組成有一定影響,這可能與Maillard反應有關。潘歡歡等[27]人對白術炮制過程中多糖與還原糖的含量變化進行研究,發現炮制過程中多糖和還原糖會發生轉化和分解作用,而在炮制過程中高濕度和高溫的條件下,還原糖會參與Maillard反應。Maillard反應是一種非酶褐變反應,它涉及羰基化合物與氨基化合物間的反應,這在食品中很重要,因為這對食品的風味和色澤起到決定性作用,另外Maillard反應中往往會引起糖的異構化和降解反應,從而改變多糖的單糖組成[28]。

通過對DPPH和ABTS自由基清除活性測定,可知黃精多糖具有一定的抗氧化活性,且抗氧化能力隨多糖的濃度增加而增大,未蒸制黃精的多糖其抗氧化活性低于蒸制后黃精多糖的抗氧化活性,但蒸制的次數對黃精多糖抗氧化活性并沒有過多的影響,只呈現略微增加的趨勢。單糖組成對多糖的結構有著影響作用,單糖組成的不同表明化學結構的不同,這對多糖的抗氧化活性及其他活性的發揮產生一定影響,為進一步開發黃精的藥用價值和經濟價值提供依據。