BX?912對前列腺癌骨轉移小鼠骨質破壞的影響

張亞男 周佺 農海斌 韋壽鋒 張瓊 白亦光 劉明富 曾高峰 宗少暉

1廣西醫科大學第一附屬醫院脊柱骨病外科（南寧530021）；2廣西醫科大學公共衛生學院（南寧530000）；3廣西醫科大學，廣西生物醫藥協同創新中心（南寧530021）

在全球男性常見的惡性腫瘤中，前列腺癌發病率僅次于肺癌居第二位，占惡性腫瘤總數的13.5%［1］。前列腺癌在早期癥狀不明顯，大約50%的患者確診即伴有骨轉移，有超過約75%的前列腺癌患者會最終發生骨轉移［2］。癌細胞侵犯到骨骼會引起的脊髓壓迫、病理性骨折等骨骼并發癥，嚴重者可能出現全身器官功能衰竭［3］。由于大多數患者確診時已經發生遠處轉移或已到晚期，臨床上對于此類患者沒有根治性方案［4］。目前治療前列腺癌主要應用手術、化療、內分泌治療、放療等方法［5-6］，近年來雖然通過改進治療技術、優化治療方案，前列腺癌的中位生存期有所提高［7］，但是前列腺癌一旦發生轉移，無法徹底治愈，而目前的放化療等治療手段給患者帶來嚴重副作用［8-9］，因此尋求防治前列腺癌及其轉移的新靶點具有重要意義。磷脂酰肌醇3?激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路參與細胞增殖、分化和葡萄糖轉運等多種細胞調節過程，是腫瘤的基礎信號通路之一［10］。磷酸肌醇依賴性蛋白激酶?1（PDK?1）被認為是PI3K?AKT 級聯的重要上游脂質激酶，通過磷酸化的方式激活AKT，觸發級聯反應，進一步激活AKT下游因子［11］。目前對PDK?1 研究逐漸成為腫瘤研究的熱點，但是對PDK?1 的具體分子機制研究尚未明確。有學者在非霍奇金淋巴瘤中抑制PDK?1 阻斷其下游的信號傳導通路，通過誘導細胞凋亡和阻斷細胞周期抑制非霍奇金淋巴瘤的生長［12］，表明通過藥物抑制PDK?1 可以抑制非霍奇金淋巴瘤生長。因此推測BX?912 可能抑制前列腺癌的生長與轉移，本研究通過體外、體內驗證其對前列腺癌的影響，為研究前列腺癌骨轉移的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料30 只8 周齡C57BL/6 雄鼠購于廣西醫科大學動物實驗中心，體質量18～22 g，RM?1 購于美國ATCC 公司，BX?912 購美國Selleck 公司，胎牛血清購于美國VWR 公司，DMEM 培養基、0.25%胰蛋白酶、PBS 和2.5%結晶紫染液購于索萊寶公司，CCK?8 購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 細胞增殖?毒性檢測（CCK?8）RM?1 以2 000個/孔密度接種于96 孔板上，置于細胞培養箱中培養，24 h 后用含有不同濃度BX?912（0、0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L）的完全培養基換液，分別培養12、24、36、48 h 后，每孔加入10 μL CCK?8，將96 孔板放回細胞培養箱孵育2 h，Microplate Reader795 酶標儀測450 nm 波長處的OD值。

1.3 細胞劃痕實驗取對數期生長RM?1 以5 ×105個/孔種植于6 孔板中培養至95%融合度，每孔加入20 μg/mL 的絲裂霉素C，放回細胞培養箱孵育2 h，吸去培養基，用滅菌100 μL 槍頭在孔中垂直劃線，PBS 小心清洗3 次，分別加入配置好含有BX?912（0、2.5、5 μmol/L）的無血清DMEM 培養基，放回細胞培養箱，在加藥后（0、8、16、24 h）時間點在倒置顯微鏡下觀察拍照，分析細胞遷移率。

1.4 細胞克隆實驗取對數生長期的RM?1，用0.25%含有EDTA 的胰蛋白酶消化下來，計數后每孔加入250 個RM?1，置于5% CO2，37 ℃細胞培養箱中培養，約12 h 后細胞貼壁，用含有不同濃度的BX?912（0、2.5、5 μmol/L）的完全培養基換液（含10%胎牛血清），每隔3 d 換液，若培養皿中出現多個肉眼可見的克隆，用結晶紫染色液參照說明書對細胞進行染色。計算克隆形成數目及克隆形成率。

1.5 前列腺癌骨轉移小鼠模型的建立30 只C57BL/6 雄鼠用5%水合氯醛（0.2 mL/只）腹腔注射，麻醉滿意后，備皮，碘伏消毒三次右下肢膝關節周圍，用微量注射器從右下肢脛骨近端脛骨頭凹點進針，旋轉穿刺2～3 mm，緩慢注射10 μL 配置好的細胞懸液（含5 × 105個RM?1），拔出注射器，碘伏消毒，待小鼠蘇醒后放回籠中。

1.6 BX?912對前列腺癌骨轉移小鼠模型干預造模成功后，30 只小鼠隨機分為3 組，分別為對照組（PBS）、低濃度組（1 mg/kg）、高濃度組（5 mg/kg）。每隔1 天腹腔注射相應劑量的藥物。14 d 取右下肢脛骨行Micro?CT 檢測（SCANCO Medical AG，型號：μCT100），掃描參數：電壓70 kV，電流200 μA，分辨率10 μm，隨機選取脛骨近端骨溶解區域分析骨體積分數，骨小梁數目及骨小梁厚度，然后游離瘤體稱重并進行統計學分析。

1.7 統計學方法使用SPSS 24.0 軟件對數據進行統計分析，計量資料采用（）表示，單因素方差分析用于比較不同組別之間的差異，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CCK?8 檢測RM?1 增殖活性結果在BX?912干預12、24、36、48 h 時間點分別通過CCK?8 檢測RM?1增殖活性。在BX?912濃度為1.25 μmol/L及以上時對RM?1 有明顯的抑制作用，并呈濃度依賴性（P＜0.05），在0.625 μmol/L 及以下濃度時，BX?912對RM?1 無毒性作用（P＞0.05，表1）。

表1 CCK?8 實驗測定RM?1 增殖活性Tab.1 The proliferative activity of RM?1 was detected by CCK?8 ±s

表1 CCK?8 實驗測定RM?1 增殖活性Tab.1 The proliferative activity of RM?1 was detected by CCK?8 ±s

注：通過CCK?8 在12、24、36、48 h 時間點測定BX?912 干預RM?1 的OD 值，*P ＜0.05

BX?912 濃度（μmol/L）0 0.156 0.313 0.625 1.25 2.5 5 10 20 40干預12 h 0.734±0.014 0.728±0.009 0.729±0.008 0.722±0.017 0.656±0.055*0.654±0.035*0.582±0.026*0.532±0.016*0.476±0.029*0.358±0.030*干預24 h 1.577±0.085 1.598±0.007 1.612±0.068 1.619±0.028 1.478±0.055*1.263±0.032*0.970±0.039*0.755±0.039*0.464±0.028*0.340±0.034*干預36 h 1.973±0.707 1.997±0.091 1.970±0.145 1.997±0.211 1.760±0.010*1.554±0.061*1.257±0.074*0.989±0.026*0.505±0.066*0.300±0.026*干預48 h 3.554±0.139 3.571±0.107 3.626±0.166 3.679±0.065 3.213±0.115*2.877±0.100*2.453±0.105*1.813±0.104*0.538±0.046*0.222±0.076*

2.2 劃痕實驗檢測RM?1 的遷移能力結果通過細胞劃痕實驗觀察BX?912 對RM?1 細胞遷移能力的影響，結果顯示BX?912 能顯著抑制RM?1 的遷移能力（圖1A），隨著BX?912 濃度的增加，抑制效果更加明顯（圖1B）。

圖1 BX?912 抑制RM?1 的遷移Fig.1 BX?912 inhibits the migration of RM?1

2.3 克隆實驗檢測RM?1 獨立生存能力克隆結果顯示，BX?912 干預組克隆形成數目較對照組低（圖2A），對克隆數目計數顯示三組克隆形成數：0 μmol/L 組＞2.5 μmol/L 組＞5 μmol/L 組（P＜0.05，圖2B），三組克隆形成率0 μmol/L 組＞2.5 μmol/L 組＞5 μmol/L 組（P＜0.05，圖2C），提示BX?912 能抑制RM?1 的獨立生存能力，隨著BX?912 濃度的增加，這種抑制作用更加明顯。

圖2 BX?912 抑制RM?1 克隆形成Fig.2 BX?912 inhibits clone formation of RM?1

2.4 BX?912 干預前列腺癌骨轉移小鼠模型結果造模7 d 后，小鼠右下肢脛骨近端可觸及綠豆大小包塊，造模成功，進行藥物干預，14 d 后處死小鼠，游離瘤體觀察瘤體大小情況（圖3A），進一步對瘤體稱重統計分析，瘤體質量的比較結果為：對照組＞低濃度組＞高濃度組（P＜0.05，見圖3B），表明BX?912 能抑制前列腺癌骨轉移瘤體的生長，并呈濃度依賴性。Micro?CT 檢測顯示骨侵蝕情況：對照組＞低濃度組＞高濃度組（P＜0.05，圖3D），表明BX?912 抑制了前列腺癌骨質破壞。選取骨溶解區域對骨參數進行統計分析，骨體積分數、骨小梁數目和骨小梁厚度（高濃度組＞低濃度組＞對照組，P＜0.05，圖3C?F），表明與對照組相比，BX?912 處理組骨質破壞受到抑制。

圖3 BX?912 對前列腺癌骨轉移模型的影響Fig.3 Effect of BX?912 on bone metastasis model of prostate cancer

3 討論

前列腺癌是一種骨轉移率極高的惡性上皮樣腫瘤，且一旦發生轉移，目前無法徹底治愈［13-14］，嚴重的并發癥及治療副作用給患者及家庭帶來巨大的精神壓力及沉重的經濟負擔［15］。前列腺癌的發生的分子機制錯綜復雜，糾其根源是基因層面上的失調［16］，所以目前對于前列腺癌的研究主要集中在其發病機制的分子信號通路上［17-18］。

PI3K/AKT 通路與前列腺癌的發生息息相關，在癌細胞轉移的過程中調節細胞的轉移、侵襲和生長，激活此通路可以促進前列腺癌的發展［19］。有研究［20］表明PI3K/AKT 信號傳導途徑在大多數癌癥中被過度激活，PI3K/AKT 通路與其他通路相互作用可以驅動前列腺癌的進展。而AKT 屬于PDK?1 的下游激活元素，理論上抑制PDK?1 可以間接抑制了AKT 的磷酸化［21］。因此推測通過靶向抑制PDK?1 可能會抑制前列腺癌生長與轉移。本研究在CCK?8 結果的基礎上設計細胞劃痕實驗和細胞克隆實驗，結果發現BX?912 顯著抑制RM?1 細胞的遷移能力和獨立生存能力。本研究結果顯示低濃度組和高濃度組的瘤體較小，骨質破壞受到抑制，并且這種抑制呈現濃度依賴性，進一步驗證了通過靶向抑制PDK?1 可以抑制前列腺癌對骨骼的破壞。

本研究仍存在不足之處，骨形成和骨吸收是成骨細胞和破骨細胞動態相互作用的過程，破骨細胞是骨組織內唯一具有骨吸收功能的細胞，其來源于骨髓源巨噬細胞的分化，分化過程受巨噬細胞集落刺激因子（M?CSF）和核因子κB 受體活化因子配體（RANKL）兩種關鍵因子的調控［22］，同時成骨細胞分泌的骨保護素（OPG）可以競爭性抑制RANKL，骨微環境的改變會使這些因子發生相應的變化，腫瘤細胞侵襲骨骼會造成這種穩態調控的失調，這涉及到多種因子及調節蛋白的參與［23］，而BX?912 在這些機制中作用尚不清楚。除此之外，有關BX?912 抑制RM?1 增殖與遷移生物學分子機制有待進一步研究。