基于AMPK/mTOR/Akt途徑探究肛門洗劑促進肛瘺大鼠術后創面愈合的機制

吳成成 謝昌營 羅文兵 肖慧榮

1江西中醫藥大學附屬醫院肛腸科（南昌330004）；2江西省分宜縣中醫院肛腸科（江西新余336600）

肛瘺是由于肛周間隙的損傷、感染或是異物等病理因素所形成的與肛周皮膚相通的異常通道，癥狀主要有局部瘙癢、疼痛、流膿等，在我國，肛瘺的發病率約占所有肛腸疾病的1.7%～3.9%［1］，且復發率較高，對患者的生活帶來了很大不便。目前臨床治療肛瘺主要以手術為主，但是由于手術方式是開放式手術，創口易被糞便污染，通常不進行縫合，因此，減輕肛瘺術后創面的炎性反應，緩解患者的疼痛，促進創面愈合對于肛瘺術后恢復至關重要［2］。肛門洗劑是在五倍子湯的基礎上發展而來，具有清熱解毒消腫、燥濕止癢止血的功效，在肛瘺、混合痔等術后廣泛應用，療效確切［3-4］。本研究通過觀察肛門洗劑對肛瘺創面修復的影響，探討肛門洗劑可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物40 只SPF 健康SD 大鼠，體質量200～220 g，雌雄各半，購于長沙天勤生物科技公司，動物許可證號：SCXK（湘）2018?0012。

1.2 藥物與試劑肛門洗劑（江西中醫藥大學附屬醫院，20190604）；高錳酸鉀（正大豐海藥業，JS030516）；血管生長因子（vascular growthrelated factors，VEGF）、促血管生成素?Ⅰ（angiopoietin?Ⅰ，Ang?Ⅰ）、促血管生成素?Ⅱ（angiopoietin?Ⅱ，Ang?Ⅱ）；白介素?1β（interleukin?1β，IL?1β），白介素?2（interleukin?2，IL?2）ELISA 試劑盒（中國欣博盛）；前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）ELISA 試劑盒（Assay 公司）；逆轉錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、mTOR、Akt、GAPDH 抗體，美國Proteintech 公司；BCA 蛋白定量試劑盒，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 主要儀器低溫高速離心機，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；X73 型倒置熒光顯微鏡，日本OLYMOUS 公司；超聲勻漿器，日本SANYO 公司；凝膠成像系統，美國BIO?RAD 公司。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及模型制備40 只SD 大鼠隨機分為正常對照組、模型組、肛門洗劑組和陽性對照組，每組10 只。除正常對照組外，其余三組參照王琛等［5］方法制作肛瘺術后創面模型。操作過程為：大鼠腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）麻醉，背部手術區備皮，碘伏消毒，于頸后2.5 cm、脊柱旁側0.5 cm 處用創傷器做一圓形切口，直徑約1 cm，深達肌層，另在尾骨旁1.5 cm 處再做一相同大小的切口，止血后用彎鉗從一切口入，鈍性分離至另一切口出，引入凡士林紗條，沿紗條注入2 mL 糞水，圓針縫合切口處皮膚，包扎，45 d 后解除，局部超聲檢查及X 線造影顯示均有瘺管形成。

1.4.2 給藥方法正常對照組不給藥；模型組：用100 mL 生理鹽水擦洗創面10 min，紗布包扎，每日2 次；肛門洗劑組：1 包肛門洗劑稀釋4 倍，取100 mL 擦洗創面10 min，紗布包扎，每日2 次；陽性對照組：高錳酸稀釋5 000 倍，取100 mL 擦洗創面10 min，紗布包扎，每日2 次；連續給藥2 周。

1.5 檢測指標

1.5.1 創面愈合率參照潘友珍等［6］方法測量創傷面積，并計算創面愈合率。

1.5.2 檢測創面肉芽組織Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ、VEGF、PGE2、IL?1β、IL?2 表達給藥結束后，取大鼠創面肉芽組織，低溫研磨，加入2 mL 裂解液勻漿，ELISA 法檢測Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ、VEGF、PGE2、IL?1β、IL?2 表達，具體操作嚴格按照說明書步驟進行。

1.5.3 HE 常規染色觀察病理改變給藥結束后，取大鼠創面組織，10%甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE 染色，觀察大鼠創面組織病理改變。

1.5.4 RT?PCR 法測定創面肉芽組織AMPK、mTOR、Akt mRNA 表達按照試劑盒說明書提取胃組織總RNA，照逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應。RT?PCR 引物序列見表1。PCR 反應條件：95 ℃45 s，95 ℃15 s，60 ℃40 s，進行45 個循環。每組進行3 次測定，取平均值，圖像分析儀掃描凝膠密度，采用2?△△CT法計算mRNA 表達水平。

表1 RT?PCR 引物序列表Tab.1 Primer sequence table for RT?PCR

1.5.5 Western blot 檢測創面肉芽組織AMPK、mTOR、Akt 蛋白表達低溫取創面肉芽組織，冷研磨后加入細胞裂解液，在4 ℃、2 000 r/min 離心15 min，BCA 蛋白定量法測定上清液蛋白濃度，取待測樣品100 μg，SDS?PAGE 電泳，轉膜，封閉，加入一抗AMPK（1∶1 000）、mTOR（1∶500）、Akt（1∶500）、GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育2 h，TBST 洗滌，ECL 顯影并掃描。

1.6 統計學方法數據統計分析采用SPSS 17.0軟件包，計量資料采用均數±標準差表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肛門洗劑對肛瘺大鼠創面愈合率的影響肛門洗劑組、陽性對照組大鼠的創面愈合率較模型組大鼠明顯提高（P＜0.05）。見表2。

表2 肛門洗劑對肛瘺大鼠創面愈合率的影響Tab.2 Effect of anal lotion on wound healing rate in anal fistula rats ±s，%

表2 肛門洗劑對肛瘺大鼠創面愈合率的影響Tab.2 Effect of anal lotion on wound healing rate in anal fistula rats ±s，%

注：與模型組比較，#P ＜0.05

組別模型組肛門洗劑組陽性對照組創面愈合率11.82±1.25 66.95±7.16#50.13±4.38#

2.2 肛門洗劑對肛瘺大鼠VEGF、Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ表達的影響與正常對照組相比，模型組大鼠的Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ、VEGF 表達明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，肛門洗劑組、陽性對照組大鼠的Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ、VEGF 表達明顯升高（P＜0.05）。見表3。

表3 肛門洗劑對肛瘺大鼠VEGF、Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ表達的影響Tab.3 Effect of anal lotion on expression of VEGF，Ang?Ⅰ，Ang?Ⅱin anal fistula rats ±s

表3 肛門洗劑對肛瘺大鼠VEGF、Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ表達的影響Tab.3 Effect of anal lotion on expression of VEGF，Ang?Ⅰ，Ang?Ⅱin anal fistula rats ±s

注：與正常對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05

組別正常對照組模型組肛門洗劑組陽性對照組VEGF（ng/L）264.09±28.4 124.59±9.92*197.34±28.75#173.79±12.71#Ang-Ⅰ（μg/L）15.96±2.31 6.41±0.53*13.52±1.14#12.88±2.07#Ang-Ⅱ（μg/L）1.71±0.11 0.95±0.07*1.54±0.12#1.43±0.13#

2.3 肛門洗劑對肛瘺大鼠PGE2、IL?1β、IL?2 表達的影響與正常對照組相比，模型組大鼠IL?1β、IL?2、PGE2 表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，肛門洗劑組、陽性對照組大鼠的IL?1β、IL?2、PGE2 表達明顯降低（P＜0.05）。見表4。

表4 肛門洗劑對肛瘺大鼠PGE2、IL?1β、IL?2 表達的影響Tab.4 Effect of anal lotion on expression of PGE2，IL?1β，IL?2 in anal fistula rats ±s

表4 肛門洗劑對肛瘺大鼠PGE2、IL?1β、IL?2 表達的影響Tab.4 Effect of anal lotion on expression of PGE2，IL?1β，IL?2 in anal fistula rats ±s

注：與正常對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05

組別正常對照組模型組肛門洗劑組陽性對照組IL?1β（pg/mL）84.97±7.65 198.08±21.36*104.30±9.58#126.89±14.24#IL?2（pg/mL）115.72±12.79 238.21±20.85*123.83±11.93#157.93±15.27#PGE2（pg/mL）87.49±7.75 426.91±33.96*136.99±14.71#166.75±15.66#

2.4 HE 常規染色觀察病理改變模型組大鼠創面表層出現明顯出血及壞死，組織高度水腫，伴大量炎性細胞浸潤，成纖維細胞分布散亂稀疏，未見新生毛細血管。肛門洗劑組、陽性對照組有新生表皮爬覆，炎性浸潤明顯減少，成纖維細胞成熟且分布整齊，膠原纖維致密且排列整齊，可見新生毛細血管分布。見圖1。

圖1 創面組織病理形態（HE，×200）Fig.1 Histopathological morphology of the wound（HE，×200）

2.5 肛門洗劑對肛瘺大鼠AMPK、mTOR、Akt mRNA 表達的影響與正常對照組相比，模型組大鼠AMPK、mTOR、Akt mRNA 表達明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，肛門洗劑組、陽性對照組大鼠AMPK、mTOR、Akt mRNA 表達明顯升高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 肛門洗劑對肛瘺大鼠AMPK、mTOR、Akt mRNA 表達的影響Fig.2 Effect of anal lotion on mRNA expression of PGE2，IL?1β，IL?2 in anal fistula rats

2.6 肛門洗劑對肛瘺大鼠AMPK、mTOR、Akt蛋白表達的影響與正常對照組相比，模型組大鼠AMPK、mTOR、Akt 蛋白表達明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，肛門洗劑組、陽性對照組大鼠AMPK、mTOR、Akt 蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。見圖3。

圖3 肛門洗劑對肛瘺大鼠AMPK、mTOR、Akt 蛋白表達的影響Fig.3 Effect of anal lotion on protein expression of PGE2，IL?1β，IL?2 in anal fistula rats

3 討論

中醫學理論認為肛瘺是由于肛周氣血不暢、濕熱聚結、邪氣留滯所致。雖可通過手術切除，但術后創面局部濕熱未盡，加之手術使肛周血脈、經絡受損，從而導致創面氣血虧虛，后期愈合不良［7-10］。因此，肛瘺術后治療應堅持清熱燥濕、補氣活血化瘀的治療原則。肛門洗劑由五倍子、苦參、白芨、桑寄生、明礬、芒硝、黃柏、荊芥等中藥組成，具有燥濕止癢止血、清熱解毒消腫的功效，在臨床治療肛瘺、痔等肛周疾病廣泛使用，可以有效改善患者臨床癥狀、促進創面愈合［11］。

炎癥與創面血液運行是影響肛瘺創面愈合的重要因素［12-13］，所以減輕創面早期炎癥反應，促進局部血液循環，對于提高肛瘺術后創口的愈合至關重要［14］。VEGF 是主要的血管生長因子，血管生成可謂創面愈合中的一個關鍵環節，研究［15］表明慢性傷中VEGF 濃度下調導致的血管生成減少是傷口難愈合的主要原因；Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ已被公認在創傷后病理性血管生成、修復中發揮關鍵作用［16-17］。PGE2 是重要的炎性介質，在局部發生傷害性刺激時迅速產生，可以激活周圍感覺神經末梢的疼痛受體，強化痛感［18］；IL?2 可以促進細胞因子的產生，促進抗體分泌和B 細胞增殖，激活巨噬細胞［19］；IL?lβ 在急性炎癥中起重要作用，可激活巨噬細胞，啟動炎癥級聯反應［20］。本研究發現，在肛瘺模型大鼠中，肉芽組織Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ、VEGF表達降低，說明大鼠血運不暢，血管生成受損；PGE2、IL?1β、IL?2 表達升高，說明大鼠具有明顯的炎癥反應；在經過肛門洗劑治療后，Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ、VEGF 表達升高，PGE2、IL?1β、IL?2 表達降低，說明肛門洗劑可以降低肛瘺大鼠創面炎癥反應，促進創面新生血管的形成，從而達到加速創口愈合，并可能通過降低PGE2 表達發揮一定的鎮痛作用。

AMPK 是調節能量代謝的關鍵分子，近年來的研究顯示AMPK 對炎癥反應有一定的抑制作用［21］，活化的AMPK 對多種細胞中促炎因子（IL?6、IL?1β）的合成及分泌具有抑制作用［22］；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種進化保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也是維持細胞生長、新陳代謝以及血管發生的重要調控元件。在創傷愈合過程中可分泌VEGF、成纖維細胞生長因子（FGF）等多種生長因子，促進創傷愈合［23］。Akt 是PI3K/Akt 信號通路下游重要的靶因子，具有促進細胞生存、抗氧化、抗凋亡等細胞保護功能。研究顯示，增加Akt的表達量，可促進神經元存活。本研究對創口新生肉芽組中AMPK、mTOR、Akt 蛋白表達進行檢測，結果顯示模型組大鼠創面AMPK、p?mTOR、p?Akt 蛋白表達明顯降低；而經肛門洗劑治療后，AMPK、mTOR、Akt 蛋白表達明顯升高。說明肛門洗劑可通過激活AMPK 蛋白表達抑制創口炎癥反應，并可通過增加mTOR、Akt 蛋白的表達促進創口處細胞的生長及增殖，加速傷口的愈合。

綜上所述，肛門洗劑可抑制肛瘺大鼠創口炎癥反應，促進血管新生及傷口愈合，其可能是通過調控AMPK/mTOR/Akt 信號通路來實現的。