hsa_circ_0006220對子癇前期滋養細胞的增殖和遷移的影響

周俏苗 林丹 許晶 吳秀菊 鐘高布 王秋艷

子癇前期（Preeclampsia，PE）是一種人類妊娠特異性、異質性、多系統疾病，以妊娠20 周后高血壓和蛋白尿新發為特征，影響3%～5%的妊娠［1］。2015年，全球有2%～8%的孕婦患有PE，死亡人數達46 900 人［2］。專家認為胎盤在這種疾病的發病機制中起著核心作用［3］。胎盤缺損，特別是滋養細胞功能障礙，包括增殖減少、過度凋亡、分化異常、遷移和侵襲受限等都與子癇前期有關［4］。既往研究表明，妊娠期間滋養細胞適時適量地增殖、分化、遷移、浸潤和凋亡，這些過程失控，滋養細胞侵襲會出現異常，導致胎盤淺著床及血管重鑄障礙，最終引起子癇前期［5］。環狀RNA（circRNAs）是一種具有共價閉合的結構，可以保護自身免受外切酶干擾的核酸分子［6］，常出現于外顯子、內含子和基因間區域［7］，通過充當蛋白質復合物組裝中的支架來調控基因表達，調節選擇性剪接及RNA-蛋白質相互作用，還可以作為miRNA 海綿發揮作用［8］。因此，circRNAs 在子癇前期中的功能作用值得深入探討。CircRNAs 在子癇前期異常表達的機制還不清楚。circRNA_001569 可以通過miR-145/HBXIP軸影響乳腺癌細胞的惡性生物學行為［9］。circTADA2As 通過靶向miR-203a-3p/SOCS3軸抑制乳腺癌進展和轉移［10］。ERα 相關的circ-SMG1 通過72/miR-141-3p/gelsolin 軸抑制肝癌細胞侵襲［11］等。滋養細胞的遷移和侵襲與腫瘤細胞遷移和侵襲的內在分子機理非常相近。因此，本研究，探索異常表達的circRNA在子癇前期的作用機制。

1 對象與方法

1.1 對象

選取2018年9月至2019年8月本院婦產科住院的子癇前期患者和正常妊娠胎盤組織各8 例，診斷及分類標準參考全國統編教材第九版《婦產科學》［12］。納入標準：①均為單胎妊娠；②均為剖宮產分娩。排除標準：①原發性高血壓、既往心肝腎及內分泌疾病史；②胎膜早破早產和感染征象。所有組織均保存在液氮中。本研究已獲得院倫理委員會批準同意，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

滋養層細胞株HTR-8/Svneo 購自于中國科學院生物化學與細胞生物學研究所。用10% 胎牛血清的RPMI-1640 培養基（SH30809.01；美國HyClone公司）（100 U/mL，青霉素，0.1 mg/mL 鏈霉素）（15140-122；美國Invitrogen），采用37℃、5% CO2培養箱（371；美國Thermo Scientific）培養。

1.2.2 siRNA 及miR-203a-3p 的抑制物inhibitor設計合成及轉染

hsa_circ_0006220 的特異siRNA 序列（SS：CACUGCAGGAUGUAGCCAAdTdT；AS：GAUUG GCUACAUCCUGCAGUG），細胞用0.25%胰酶-EDTA（40127ES60；上海翊圣）溶液消化，5×105個/孔接種到6 孔板中，用無RNase 水溶解siRNA 片段溶于opti-MEM 中，通過LipofectamineTM2000（11668-027；美國Invitrogen）進行轉染，si-NC 序列（SS：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT；AS：ACGUGACACGUUCGGAGAATT）作為陰性對照。48 h 后收集細胞。

1.2.3 組織和細胞的RNA 提取和熒光定量PCR

用總RNA 提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取總RNA。在梯度PCR 儀（美國ABIMinAmp）上利用cDNA 逆轉錄試劑盒（K1691；美國Thermo Scientific）將RNA 逆轉錄成為cDNA，PCR 反應體系：cDNA 模板1 μL、上/下游引物2 μL、SYBR premix Ex Taq 5 μL。PCR 反應條件：95℃預變性10 s、95℃變性5 s、61℃復性20 s、72℃延伸10 min（40 個循環）。結果分析：采用Comparative Ct 法計算目標RNA 的表達量。每個cDNA樣本每對引物重復測定3 次，SOCS3基因表達測定以GADPH作為內參對照。其他RNA 的表達測定，以U6為內參對照。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.4 MTS 法檢測HTR-8/Svneo 細胞增殖

取對數生長期的兩組HTR-8/Svneo 細胞，分別以3 000 個細胞/孔接種于96 孔板中，每株細胞3個復孔，于37℃、5% CO2培養箱中繼續培養。分別在0、24、48、72 h 后加入MTS 試劑（ab223881；美國abcam），比例為1∶10。37℃孵育4 h 后，檢測490 nm 波長處的光密度（optical density，OD）值（SynergyH1 酶標儀；美國Biotek），繪制細胞生長曲線。

1.2.5 劃痕實驗檢測細胞侵襲

對數生長期的細胞經胰酶消化，接種至6 孔板中，1×106個細胞/孔，分別轉染si-NC 和siRNA 培養24 h。待細胞完全貼壁后換液，用1cg/mL 絲裂霉素C（10107409001；瑞士羅氏）處理1 h，劃痕，基礎培養基培養，分別于0、6、24、48 h 隨機選取8 個劃痕視野拍照，Image-J 軟件量取距離并計算遷移率，遷移率=（0 h-其他時間點）/0 h。

1.2.6 Transwell 檢測細胞遷移

將細胞懸浮于無血清培養基用siRNA 或NC片段處理24 h。1×105個細胞接種到上室培養過夜。用棉簽擦拭上表面細胞，其中低表面重新混合并用0.1%結晶紫染色。每個孔室隨機200×拍照五個視野，并計數。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0 軟件進行數據分析；計量資料以（）表示，雙尾t檢驗用來分析各組指標之間的關系；以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hsa_circ_0006220 在子癇前期胎盤組織中的表達

qRT-PCR 結果顯示，子癇前期的胎盤組織與正常妊娠胎盤組織比較，hsa_circ_0006220（t=3.50，P=0.01）和hsa_circ_0001681（t=2.71，P=0.03）的表達差異有統計學意義（P＜0.05）；hsa_circ_0006990（t=1.16，P=0.31）和hsa_circ_0072309（t=0.65，P=0.55）的表達在兩組的表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 正常妊娠胎盤組織和子癇前期胎盤組織中4 種circRNA 的表達情況Figure 1 The expression of 4 circRNAs in normal pregnancy placental tissues and preeclampsia（PE）placental tissues

2.2 沉默hsa_circ_0006220 對滋養細胞株HTR-8/Svneo 的增殖、侵襲與遷移的影響

轉染siRNA 后hsa_circ_0006220 的表達明顯下降，見圖2A。沉默hsa_circ_0006220 后，HTR-8/Svneo 細胞的活力在72 h 時呈明顯增加趨勢，見圖2B。HTR-8/Svneo 細胞的侵襲和遷移能力均明顯增加，見圖2C。

圖2 siRNA 干擾hsa_circ_0006220 表達后對滋養細胞HTR-8/Svneo 增殖和遷移的影響Figure 2 Effects of siRNA interference with hsa_circ_0006220 expression on proliferation and migration of trophoblast cells HTR-8/SVneo

2.3 hsa_circ_0006220 與miR-203a-3p 之間的關系

hsa_circ_0006220 來源于TADA2A 的 第6 個外顯子，具有多個miR-302 家族，miR-203a-3p，miR-520d-3p 等結合位點，見圖3A。研究通過siRNA來沉默hsa_circ_0006220，對miR-302b，miR-302c，miR-302d，miR-520d 和miR-203a 進行qRT-PCR 定量后發現，沉默hsa_circ_0006220 后，miR-203a 表達顯著提高。見圖3B、圖3C 和表2。

表2 兩組之間miRNA 表達量比較（±s）Table 2 Comparison of expression of miRNA between 2 groups（±s）

表2 兩組之間miRNA 表達量比較（±s）Table 2 Comparison of expression of miRNA between 2 groups（±s）

組別si-NC si-RNA t 值P 值miR-302b 0.96±0.09 0.54±0.06 5.54 0.00 miR-302c 1.08±0.07 0.64±0.02 8.23 0.00 miR-302d 0.96±0.08 2.01±0.19 7.26 0.00 miR-520d 0.93±0.08 0.73±0.023 3.40 0.01 miR-203a 1.01±0.01 4.98±0.20 28.07 0.00

圖3 hsa_circ_0006220 與miR-203a-3p 的關系以及它們在滋養細胞HTR-8/Svneo 中的表達Figure 3 The relationship between hsa_circ_0006220 and miR-203a-3p and their expression in trophoblast cells HTR-8/SVneo

2.4 沉默hsa_circ_0006220 對SOCS3 基因表達的影響

沉默hsa_circ_0006220 后SOCS3基因與對照組相比呈顯著下降趨勢。見圖4。

圖4 滋養細胞HTR-8/Svneo 中轉染si-RNA 后對SOSC3基因表達的影響Figure 4 After si-RNA transfection in trophoblast cells HTR-8/SVneo，the expression of SOSC3 gene decreased significantly

3 討論

子癇前期是一種嚴重的妊娠并發癥，未經治療的子癇前期可能會導致孕產婦及胎兒的死亡［13］。然而，子癇前期的風險因素只能檢測出30%可能患子癇前期的女性［14］。目前已有證據表明非編碼RNA（noncoding RNAs，ncRNAs）與子癇前期之間具有相關關系［15］。環狀RNA（Circular RNAs，circRNAs）作為一種ncRNAs，已被證明可以作為其他RNA 轉錄的潛在調控因子，如microRNAs（miRNAs）。MiRNAs 影響從發育途徑到腫瘤發生的幾乎所有細胞過程。事實上，miRNA能夠調控大多數人類蛋白的表達［16］。環狀RNA在生物發育機制中起著非常關鍵的作用，主要包括調節miRNA、內源性RNA 表達，及作為不同疾病診斷生物標志物［17］。

在PE 胎盤中，ceRNA 譜分析有助于發現相關的生物調控過程或途徑，這對PE 發病機制的探索非常有利［18］。環狀RNA 作為一種競爭性內源性RNA，是一種相對于其他類型的RNA 樣本量更大、特異性更高，穩定性更高的RNA。因此，環狀RNA 被認為是不同疾病的潛在生物標志物之一。最近的報道表明，環狀RNA 可調節PE 進展［19］，并發現系列circRNA 在子癇前期的胎盤中呈現高表達趨勢，可能是通過激活miRNA 海綿來參與子癇前期發病機制。

miRNA 是一類由內源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，它們在轉錄后調節靶mRNA 的表達，參與了細胞代謝、信號轉導、細胞粘附、細胞運動、細胞分化和凋亡［20］。本研究通過進一步分析hsa_circ_0006220 結合的miRNA，結果證實hsa_circ_0006220 與miR-203a-3p 的結合能力最強，這與hsa_circ_0006220 可通過靶向miR-203a-3p/SOCS3軸來抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲的機制非常相似［10］。Xiao 等也報道ERα 相關的circ-SMG1 通過72/miR-141-3p/gelsolin軸抑制肝癌細胞侵襲［11］等。本研究結果說明hsa_circ_0006220 是抑制滋養細胞侵襲和遷移的關鍵因素。因此滋養細胞的遷移和侵襲與腫瘤細胞遷移和侵襲的內在分子機理存在相似性，都是通過circRNA 吸引miRNA，從而導致細胞遷移和侵襲的減弱。

本研究結果發現，沉默hsa_circ_0006220 后SOCS3基因表達也顯著降低，再次證實hsa_circ_0006220 靶向的基因是SOCS3。SOCS3基因是許多細胞因子如白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子等信號通路的負反饋調節因子，參與人體免疫、炎癥、脂質代謝及腫瘤的發生與轉移等。

綜上所述，circRNA hsa_circ_0006220 在子癇前期胎盤組織中表達升高，在滋養細胞中沉默后，細胞遷移和侵襲能力明顯增強，能夠作為miR-203a-3p的分子海綿，從而恢復SOCS3基因的表達。circRNA hsa_circ_0006220 可能為未來子癇前期的臨床診斷和治療提供新的分子靶點。