KLF4、LDH聯合P53預測DLBCL標準治療反應性價值及意義

秦福麗 郭志強 李小雨

彌漫性大B 細胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）占成人非霍奇金淋巴瘤的30%～40%，呈彌漫侵襲性生長［1］。CHOP（硫酸長春新堿+環磷酰胺+鹽酸表柔比星+地塞米松）或R-miniCHOP（減低劑量的CHOP）聯合CD20 單克隆抗體利妥昔單抗是治療DLBCL 標準方案，但部分患者仍出現復發或預后不良，呈現出不同的治療反應性［2］。鋅指樣轉錄因子4（Krüppel-like factor 4，KLF4）是含鋅指結構的轉錄因子家族一員，在腎透明細胞癌中表達降低，且低表達KLF4 與大腸癌患者更差預后有關，但與DLBCL 治療反應性關系尚未闡明［3-4］。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）分布于機體腎臟、骨骼等多種組織和器官，在DLBCL 患者中水平升高，但是否可影響患者治療反應性仍有待探討［5］。P53 是一種抑癌基因，通過細胞凋亡、DNA 修復、誘導細胞周期阻滯及調控多種信號轉導抑制腫瘤的發生發展，但在DLBCL 領域尚存在爭議，在DLBCL 治療反應性中扮演何種角色尚不明確［6］?；诖吮狙芯刻接慘LF4、LDH、P53 與DLBCL 標準治療反應性關系及聯合預測價值，報告如下。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取2017年1月至2020年3月本院收治的62例DLBCL 患者，根據治療反應性分為緩解組（n=42）、非緩解組（n=20）。納入標準：①符合DLBCL診斷標準［7］；②無化療禁忌癥；③首次確診與治療；④免疫組化檢查CD20 陽性。排除標準：①心肝腎功能嚴重不全者；②活性性出血者；③其他系統原發性惡性腫瘤者；④伴有急性感染類疾病者；⑤妊娠期、哺乳期者。本研究獲醫院倫理委員會審核通過，患者及家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 資料收集

收集患者年齡、性別、體質量指數、飲酒史、吸煙史、Ann Arbor 分期、受累部位、細胞起源亞型、合并疾病、國際預后指數（International Prognostic Index，IPI）評分［8］，其中IPI 評分于治療前評估，0～5分，分值越高，預后危險度越高。

1.2.2 檢測方法

治療前通過活檢獲取DLBCL 標本，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測KLF4mRNA，KLF4mRNA 的上游引物5′-GGCTGATGGGCAA GTTTGTG-3′，下游引物5′-CAAGTGTGGGTGGCTGTTCT-3′，以β-actin作為內參，內參β-actin的上游引物序列：5′-GAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3′，下游引物序列：5′-CGATGCCGTGCTC GATGGGG-3′，Ct（Cycle threshold）值是每個反應管內熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數，收集Ct 值后應用ΔΔCt 法檢測基因的相對表達量，試劑盒購于寶生物（大連）有限公司，嚴格按照試劑盒說明書操作；采用間期熒光原位雜交檢測P53 基因缺失率，試劑盒購于上海嵐派生物有限公司，P53 基因的5，和3，探針均為綠色熒光標記，基因丟失時僅顯示1 個和0 個綠色信號；并于治療前采集外周血5 mL，采用比色法檢測血清LDH，試劑盒購于上海滬崢生物科技有限公司。

1.2.3 治療方法及治療反應性評估［7］

＜80 歲患者，采用CHOP 聯合利妥昔單抗注射液，≥80 歲者采用R-miniCHOP 聯合利妥昔單抗注射液，21 周為1 個治療周期，共治療6 個周期；治療后療效分為完全緩解、部分緩解、病情穩定、疾病進展，其中完全緩解、部分緩解納入緩解組。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 處理數據，計量資料符合正態分布時以（）表示，行t檢驗，計數資料用n（%）表示，行χ2檢驗，采用Pearson 分析KLF4mRNA、LDH與IPI 評分關系，采用多因素Logistic 回歸方程分析治療反應性的相關影響因素，采用受試者工作特征曲線（ROC）及ROC 下面積（AUC）分析各指標預測治療反應性的價值。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組基線資料比較

兩組年齡、性別、體質量指數、飲酒史、吸煙史、受累部位、細胞起源亞型、合并疾病比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；緩解組Ann Arbor 分期、IPI 評分與非緩解組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組基線資料對比［（±s），n（%）］Table 1 Comparison of baseline data between 2 groups［（±s），n（%）］

表1 兩組基線資料對比［（±s），n（%）］Table 1 Comparison of baseline data between 2 groups［（±s），n（%）］

資料年齡（歲）性別（男/女）體質量指數（kg/m2）飲酒史吸煙史Ann Arbor 分期緩解組（n=42）61.15±11.24 24/18 24.25±1.57 35（83.33）20（47.62）非緩解組（n=20）63.58±10.29 9/11 23.99±1.66 13（65.00）6（30.00）t/χ2值0.817 0.802 0.599 1.662 1.727 P 值0.417 0.370 0.552 0.197 0.189ⅠⅡⅢⅣ9（21.43）19（45.24）11（26.19）3（7.14）1（5.00）2（10.00）8（40.00）9（45.00）3.856＜0.001受累部位淋巴結內淋巴結外細胞起源亞型生發中心B 細胞樣非生發中心B 細胞樣合并疾病高脂血癥糖尿病心臟病高血壓IPI 評分（分）26（61.90）16（38.10）15（75.00）5（25.00）1.037 0.309 9（21.43）33（78.57）9（45.00）11（55.00）3.654 0.056 8（19.05）10（23.81）1（2.38）6（14.29）1.40±0.42 3（15.00）3（15.00）2（10.00）1（5.00）2.61±0.59 0.001 0.214 0.454 0.424 9.271 0.973 0.644 0.500 0.515＜0.001

2.2 兩組各指標比較

緩解組KLF4mRNA 高于非緩解組，LDH、P53基因缺失率低于非緩解組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組各指標比較［（±s），n（%）］Table 2 Comparison of indicators between 2 groups［（±s），n（%）］

表2 兩組各指標比較［（±s），n（%）］Table 2 Comparison of indicators between 2 groups［（±s），n（%）］

指標KLF4 mRNA LDH（U/L）P53 基因缺失率緩解組（n=42）0.97±0.30 267.52±85.63 18（42.86）非緩解組（n=20）0.56±0.14 368.49±90.82 16（80.00）t/χ2值5.800 4.257 7.547 P 值＜0.001＜0.001 0.006

2.3 KLF4 mRNA、LDH 與IPI 評分關系

采用Pearson 進行相關性分析，結果顯示，KLF4mRNA 與IPI 評分呈負相關（r=-0.646，P＜0.001），LDH 與IPI 評分呈正相關（r=0.623，P＜0.001）。

2.4 治療反應性的多因素Logistic 回歸方程分析

Logistic 回歸方程分析顯示，將Ann Arbor 分期、IPI 評分控制后，KLF4mRNA、LDH、P53 基因缺失仍與治療反應性相關（P＜0.05）。見表3。

表3 治療反應性的多因素Logistic 回歸方程分析Table 3 Multivariate Logistic regression equation analysis of treatment response

2.5 各指標預測治療反應性的ROC

以緩解組為陽性樣本，以非緩解組為陰性樣本，繪制各指標預測治療反應性的ROC，結果顯示，KLF4mRNA+LDH+P53 基因預測緩解的AUC為0.962，大于各單一指標。見表4、圖1。

表4 ROC 分析結果Table 4 ROC curve results

圖3 各指標預測治療反應性的ROCFigure 3 ROC of each index predicting treatment response

3 討論

KLF4基因定位于9q31，在巨噬細胞、血管內皮等機體多種組織和細胞中均有表達，參與細胞生長、增殖、凋亡等多個生命活動的調控［9-10］。本研究結果顯示，與緩解患者相比，非緩解患者KLF4mRNA 較低，與IPI 評分呈負相關，是治療反應性的相關影響因素。林志美等［11］報道，KLF4mRNA 在DLBCL 患者中水平降低，增加KLF4mRNA 表達可抑制DLBCL 細胞增殖和侵襲遷移，證實KLF4mRNA 具有抑癌作用。高表達的KLF4mRNA 能破壞新生血管形成，阻斷腫瘤細胞血供，誘導腫瘤細胞凋亡，KLF4 mRNA高表達時，還能抑制磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B 通路的異常激活，從而對DLBCL 發揮抑制作用［12］。后續的ROC 分析顯示，當KLF4 mRNA＞0.85 時，預測緩解的AUC為0.829，能為臨床提供量化的數據參考。

LDH 系糖酵解酶，分布于機體所有組織細胞的胞質內，被認為是DLBCL 患者預后的相關影響因素，但對DLBCL 標準治療方案治療反應性影響的報道較少［13］。本研究結果表明LDH 具有作為治療反應性預測標志物的潛質。LDH 與腫瘤微環境、線粒體呼吸抑制等有關，當發生腫瘤時，即使在供氧充足調節下，腫瘤細胞糖酵解作用亦加強，以滿足惡性增殖的需求，故伴有LDH 升高，因此LDH 常被用于腫瘤的診斷、療效及預后的判斷。本研究發現，LDH 水平越高，治療反應性越差，這可能是LDH 較高患者，腫瘤糖酵解作用較強，腫瘤細胞惡性增殖較明顯造成的，可見臨床上對LDH 水平較高患者宜進行全面的評估，必要時聯合其他方案或更換二線方案，以增加患者受益，促進病情轉歸。

P53基因定位于17p13.1，具有抑制腫瘤發生和進展的作用［14］。研究［15］發現，P53基因突變與DLBCL 發病密切相關。目前關于P53基因在惡性腫瘤領域表達情況存在較大爭議，如丁欣等［16］報道，P53 陽性患者總生存和無進展生存期縮短，呈現出更差的預后。造成這種差異的原因是P53 陽性定義方法不同造成的，丁欣等將P53基因發生了突變定義為P53 陽性，柴成國等將P53基因缺失定義為陽性，在此前提限定下，P53 基因突變與P53基因缺失從本質上講，意義是相同的，因此認為研究結果是一致的。P53基因能通過編碼細胞周期調控蛋白，控制細胞分裂周期的啟動，并能介導與啟動損傷細胞的凋亡活動，起到減緩和監視細胞分裂作用，當P53基因突變或缺失時，對細胞周期控制功能和細胞凋亡活動的管理能力減弱或消失，故呈現出促癌作用。

綜上，KLF4mRNA、LDH、P53 基因缺失與DLBCL 標準治療反應性及預后有關，在缺乏有效手段時，可作為預測緩解的標志物為臨床提供重要參考信息。