吸煙相關COPD肺微生態菌群、Treg/Th17、炎癥在發病中的作用機制

王輝 葉彩虹 馬煥麗 孫俊生 陳斯亮 張韶斌★

慢性阻塞性肺疾?。–hronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一種以持續性氣流受限為特征的慢性氣道炎癥［1］，香煙煙霧是其原發病因之一［2］，但其在COPD 發病中的具體作用機制仍需進一步研究。關于香煙煙霧暴露對下呼吸道菌群分布影響的小鼠實驗表明［3］，香煙煙霧暴露可能通過加快致病菌生長速度，誘導下呼吸道菌群組成改變，引起宿主下呼吸道免疫反應，增加肺部疾病發生風險。另有學者指出［4］，吸煙可刺激支氣管上皮細胞，募集中性粒細胞、巨噬細胞等天然免疫細胞，異常增殖輔助性T 細胞Th17（T helper cells-17，Th17），破壞調節性T 淋巴細胞（Regulatory T cells，Treg）/Th17平衡，降低免疫抑制功能，加重肺部炎癥反應。本研究嘗試探討吸煙相關COPD 肺微生態菌群、Treg/Th17、炎癥之間關系及在發病中的作用機制。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選取2019年4月至2020年3月本院COPD 穩定期患者68 例，另選取同期肺功能正常者68 例。根據是否吸煙將COPD 穩定期患者分為吸煙COPD 組（n=20）、戒煙COPD 組（n=29）、不吸煙COPD 組（n=19）；肺功能正常者分為吸煙肺功能正常組（n=22）、戒煙肺功能正常組（n=26）、不吸煙肺功能正常組（n=20）。納入標準：①COPD 患者均符合COPD 診斷標準［5］；②肺功能正?；颊呓浄喂δ軆x檢查未發現肺功能受限，且未合并其他器質性疾??；③吸煙狀態定義［6］：吸煙者為截至目前使用≥100 支香煙，且≥1 次/月，目前并未戒斷；戒煙者即從前吸煙者截至目前使用≥100 支香煙，但目前已戒斷≥12 個月；不吸煙者為截至目前從不使用或者使用＜100 支，且目前不吸煙≥12 個月。排除標準：①近6 個月內有急性COPD 發作史者；②合并支氣管哮喘、支氣管擴張及其他肺部疾病者；③被動吸煙者；④精神行為異常者。本院倫理委員會經審核評議同意本研究，研究對象均知情同意。

1.2 儀器與方法

①所有研究對象均戒煙12 h，清晨空腹抽取靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸抗凝，4℃保存備用；采集肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage，BAL）50 mL，4℃保存備用。②BAL 離心處理（500 g，4℃離心，10 min），qPCR 法提取DNA，采用454 焦磷酸法對細菌16sRNA 進行測序，后采用Quantitative Insights into Microbial Ecology 法分析16sRNA 數據，獲取肺微生態菌群多樣性（Chao 指數、Simpson 指數）。③采用美國貝克曼庫爾特公司DxFLEX 型流式細胞儀檢測外周血、BAL 中Treg 細胞與Th17細胞含量；室溫條件下，2 800 r/min 離心10 min，采用瑞士帝肯公司SPARK 10M 酶標儀以上海江萊生物科技有限公司酶聯免疫吸附試驗試劑盒（規格：96T）測定血清和BAL 上清白細胞介素（Interleukin，IL）-17、IL-10、IL-35、IL-6 及IL-8。

1.3 統計學方法

采用統計學軟件SPSS 22.0 進行數據處理；計量資料以（）描述，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料用n（%）表示，行χ2檢驗；采用Spearman 相關系數模型分析吸煙與肺微生態菌群、Treg/Th17、炎癥因子的關系；采用Pearson 相關系數模型分析肺微生態菌群、Treg/Th17、炎癥因子之間相關性。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 6 組基線資料比較

6 組第1 s 用力呼氣容積（forcedexpiratory volume in one second，FEV1）占預計值百分比、FEV1與用力肺活量比值（forced vital capacity，FVC）比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 6 組基線資料比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of baseline data of 6 groups［n（%），（±s）］

表1 6 組基線資料比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of baseline data of 6 groups［n（%），（±s）］

注：與不吸煙肺功能正常組比較，aP＜0.05。

組別吸煙COPD 組戒煙COPD 組不吸煙COPD 組吸煙肺功能正常組戒煙肺功能正常組不吸煙肺功能正常組F/χ2值P 值n 20 29 19 22 26 20男性12（60.00）15（51.72）10（52.63）8（36.36）11（42.31）10（50.00）3.024 0.696年齡（歲）60.49±8.27 58.76±9.41 57.35±10.64 59.23±8.61 58.57±7.62 57.19±9.84 0.366 0.871肺功能FEV1占預計值百分比（%）50.73±6.42a 56.29±8.37a 60.36±5.29a 80.24±2.83a 82.45±3.39a 83.49±5.38 149.503＜0.001 FEV1/FVC（%）41.60±6.48a 47.45±6.96a 53.49±7.37a 79.52±7.36a 80.46±6.23a 82.09±8.21a 155.373＜0.001

2.2 6 組肺微生態菌群多樣性、外周血、BAL 中Treg/Th17、炎性因子比較

Chao 指數、外周血和BAL 中Treg/Th17、IL-10、IL-35 指標在各組間比較，吸煙COPD 組＜戒煙COPD組＜非吸煙COPD 組＜吸煙肺功能正常組＜戒煙肺功能正常組＜非吸煙肺功能正常組，Simpson指數在各組間比較，吸煙COPD組＞戒煙COPD組＞非吸煙COPD組＞吸煙肺功能正常組＞戒煙肺功能正常組＞非吸煙肺功能正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2、表3。

表2 6 組肺微生態菌群多樣性比較（±s）Table 2 Comparison of the diversity of the microflora in the lung of 6 group（±s）

表2 6 組肺微生態菌群多樣性比較（±s）Table 2 Comparison of the diversity of the microflora in the lung of 6 group（±s）

注：與不吸煙肺功能正常組比較，aP＜0.05。

組別吸煙COPD 組戒煙COPD 組不吸煙COPD 組吸煙肺功能正常組戒煙肺功能正常組不吸煙肺功能正常組F 值P 值n 20 29 19 22 26 20 Simpson 指數3.86±0.83a 2.62±0.55a 1.85±0.40a 1.15±0.36a 0.73±0.19a 0.35±0.10 170.553＜0.001 Chao 指數94.49±30.89a 142.69±32.61a 185.81±49.50a 231.65±53.42a 288.44±63.69a 357.49±92.58 63.135＜0.001

表3 6 組外周血、BAL 中Treg/Th17、炎性因子比較（±s）Table 3 Comparison of treg/th17 and inflammatory factors in peripheral blood and BAL of 6 groups（±s）

表3 6 組外周血、BAL 中Treg/Th17、炎性因子比較（±s）Table 3 Comparison of treg/th17 and inflammatory factors in peripheral blood and BAL of 6 groups（±s）

注：與不吸煙肺功能正常組比較，aP＜0.05。

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2.3 吸煙與肺微生態菌群、Treg/Th17、炎癥因子的關系

吸煙與Chao 指數、外周血和BAL 中Treg/Th17、IL-10、IL-35 呈負相關，與Simpson 指數、外周血和BAL中IL-17、IL-6、IL-8呈正相關（P＜0.05）。見表4。

表4 吸煙與肺微生態菌群、Treg/Th17、炎癥因子的關系Table 4 Relationship between smoking and pulmonary microecological flora，Treg/Th17 and inflammatory factors

2.4 肺微生態菌群、Treg/Th17、炎癥因子之間相關性

Pearson 相關性分析顯示，肺微生態菌群多樣性、Treg/Th17、炎性之間存在良好線性相關性（P＜0.05）。見表5、6。

表5 肺微生態菌群與Treg/Th17、炎癥因子之間相關性Table 5 Correlation between lung microbiota and Treg/Th17，inflammatory factors

表6 Treg/Th17 與炎癥因子之間相關性Table 6 Correlation between Treg/Th17 and inflammatory factors

3 討論

學者報道指出［7］，肺部菌群定植與COPD 肺部炎癥反應、局部免疫應答等均存在一定聯系。但吸煙對肺微生態菌群的影響及其在COPD 發病機制中的作用鮮有報道。本研究結果顯示，吸煙COPD患者Simpson 指數升高，Chao 指數下降。Zhang等［8］研究亦發現，吸煙是影響肺微生物組變異的因素，可改變下呼吸道微生態多樣性及群落結構，亦是炎癥性肺疾病的重要病因。結合陳琳等［9］觀點認為上述結果可能是吸煙降低氣道黏膜清除能力，微生物進入下呼吸道后定植于肺部，進一步損害黏膜纖毛清除功能，增加黏液生成量，引起肺部菌群紊亂，破壞肺部防御功能，加重氣道上皮損傷，識別受體，引起宿主炎癥免疫反應，最終形成惡性循環。

既往研究已證實［10］，Th17/Terg 紊亂在COPD發生、發展中扮演著重要角色。在COPD 中，Th17細胞可上調IL-17、IL-濃度，誘導單核巨噬細胞、中性粒細胞大量聚集于肺部，提高彈性蛋白酶、金屬蛋白酶等多種酶含量，加重肺組織損傷，誘發氣道炎癥，釋放大量趨化因子與炎性介質，激發炎癥級聯反應，進一步加快COPD 病情進展；Treg 可通過釋放大量IL-10、IL-35 等抗炎因子，抑制Th17 細胞免疫活性的作用，避免過度免疫炎癥反應所致組織損傷加重，發揮免疫調節作用［11］。另有研究發現［12］，尼古丁作為香煙煙霧主要成分之一，可影響免疫監視功能，引起T 細胞介導的免疫應答反應。同時有學者指出［13］，吸煙影響COPD 患者肺功能康復原因可能與吸煙誘導炎性因子分泌、拮抗細胞免疫功能等因素有關。本研究結果與葉彩虹等［14］研究結果相似，考慮機制可能在于香煙煙霧會釋放尼古丁類、胺類等有害物質，導致Th17細胞異常增殖與活化，促使IL-17、IL-6 水平升高，而氣道炎性因子水平持續性增加，會引起氣道過激炎癥狀態，加重氣道上皮損傷，形成內源性抗原持續暴露，進而導致氣道、肺組織靶向性慢性炎性反應，增加COPD 發生風險。由此推測，肺微生態失調-肺免疫紊亂-炎癥浸潤可能是吸煙相關COPD的發病機制。

綜上所述，肺微生態菌群失衡、Treg/Th17 紊亂、炎癥之間相互影響可能在吸煙相關COPD 發病機制中起著重要作用。但本研究存在一定局限性，如納入樣本量少、單中心研究，今后需擴大樣本量，開展多中心研究，以進一步證實研究所得結果。