基于生物信息學分析miR-655在口腔鱗狀細胞癌中的表達及功能探討

王曦 戈春城 童國勇 徐佳

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)，是口腔頜面部常見的惡性腫瘤，占比約為90%[1]。OSCC具有浸潤性強、淋巴結易轉移的特點，是導致患者5 年內總的生存率不到50%的主要原因[2-3]。研究OSCC的發病機制，尋找有效的分子靶點對OSCC的診斷及治療具有重要意義。目前隨著高通量基因測序技術在腫瘤中的應用，已有研究探討了某些mRNA或miRNA分子對OSCC的發生發展和預后的影響[4-5]。

microRNAs(miRNAs)是在真核生物中發現的一類可在轉錄及轉錄后水平調控靶基因表達的非編碼RNA，長約20～25 個核苷酸，目前已成為腫瘤研究的熱點[6-7]。miR-655位于14號染色體的 q32.31位點，參與基因表達的調控,影響細胞增殖和生長等生物學過程。研究報道miR-655具有抑制腫瘤的作用[8]，然而目前對miR-655在OSCC的研究國內尚未見報道，因此本研究擬利用公開發表的的RNA-seq數據，探討miR-655在OSCC患者中的表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 數據資料收集

1.1.1 TCGA數據收集 從癌癥和腫瘤基因圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)(https://cancergenome.nih.gov/)數據庫中下載342 例OSCC樣本及臨床數據(年齡、性別、腫瘤分級、腫瘤分期、吸煙、飲酒史、總生存期)和44 例癌旁樣本，該miRNA數據集采用RNA-seq技術檢測基因表達。

1.1.2 OSCC患者樣本收集 2018 年01 月～2020 年01月經恩施土家族苗族自治州中心醫院口腔科手術切除的40 例OSCC患者，術后病理科確診，收集癌組織及癌旁組織兩份標本，入組患者未行放化療、靶向治療等治療方案，置于-80 ℃保存備用。本研究征得患者及家屬的知情同意，并獲得本院倫理委員會批準。

1.1.3 主要試劑及儀器 正常人口腔上皮細胞HOK及OSCC細胞系(TSCCa、CAL-27、SCC-4、HN-6)(中科院上海細胞庫)；胎牛血清、脂質體Lipofectamine2000、DMEM培養基(Gibco公司，美國)；TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒和SYBR Green PCR Master mix[寶生物工程(大連)有限公司]；Transwell小室和Matrigel膠(BD公司，美國)；細胞增殖試劑盒(CCK8)(上海碧云天生物科技有限公司)；miR-655模擬物(Mimics)和陰性對照(NC)(廣州市銳博生物科技有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 miR-655的表達水平 分析miR-655在342 例OSCC樣本及44 例癌旁樣本的表達水平。同時，TRIzol法提取總RNA,采用ND-1000行核酸定量，One Step PrimeScript?miRNAcDNA合成試劑盒，按步驟進行逆轉錄反應，qRT-PCR條件為： 95 ℃預變性10 min，40 個循環(95 ℃ 10 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s)。miR-655上游引物：5' -TCCGAACATGGTTAA-3' ，下游引物：5' -GTGCAGGGTCCGAGG-3' ，以U6核小分子RNA為內參，表達量采用2-ΔΔCt法計算。

1.2.2 數據篩選及分組 整理342 例OSCC樣本及其臨床數據，以 miR-655表達的中位值，將OSCC樣本分為miR-655高表達組(n=171)和低表達組(n=171)。比較miR-655表達與OSCC患者的臨床特征和預后的相關性。

1.2.3 qPCR檢測miR-655在OSCC細胞的表達及轉染 將正常人口腔上皮細胞HOK及OSCC細胞系(TSCCa、CAL-27、SCC-4、HN-6)加入到DMEM完全培養基中，置于37 ℃、5%CO2的條件下培養。每隔1～2 d更換培養基，當細胞融合度達80%以上時傳代，qRT-PCR檢測miR-655在OSCC細胞的表達。設立脂質體向OSCC細胞轉染miR-655 Mimics組、miR-655 NC組及脂質體處理的空白對照組，按CCK8試劑盒說明，檢測轉染后的細胞增殖水平。

1.2.4 轉染Mimics后OSCC細胞的遷移及侵襲能 取對數生長期及狀態良好的轉染Mimics人OSCC細胞，設為miR-655 Mimics組、miR-655 NC組及脂質體處理的空白對照組，胰酶消化，無血清培養基重懸，備用。低溫環境下在24 孔板中預先加入500 μL的含有10%胎牛血清的培養基，放入Transwell小室，在上室面接入100 μL(1×105/mL)細胞懸液，置于37 ℃ 5%CO2孵箱培養24 h，取出Transwell小室，用棉簽將上室未遷移的細胞擦干凈，遷移至下室的細胞予以甲醛固定25 min，0.1%結晶紫染色，室溫放置20 min，光學顯微鏡計算細胞數目，隨機5 個視野計數。侵襲實驗，預先采用，Matrigel膠預先在4 ℃冰箱過夜融化，用培養基按1∶8比例稀釋，包被Transwell小室，余步驟同遷移實驗。

1.3 統計分析

2 結 果

2.1 miR-655在OSCC中的表達水平

342 例 OSCC組miR-655的表達量為(1.81±0.05)，44 例癌旁組的表達量為(2.43±0.18)(t=1.141，P<0.001)(圖 1A)；qRT-PCR測定miR-655在40 例OSCC患者中，癌及癌旁組織標本的表達。結果示：癌和癌旁組織中的miR-655的表達分別為1.94±0.12和2.68±0.21(t=3.077，P=0.003)，miR-655在癌組織中低表達，驗證了TCGA分析結果(圖 1B)。

圖 1 miR-655在OSCC和癌旁組織中的表達水平

2.2 miR-655與OSCC患者臨床特征的相關性

342 例OSCC患者，miR-655高、低表達組與患者的年齡(P=0.102)、性別(P=0.567)、腫瘤分期(P=0.526)、吸煙史(P=1.000)和飲酒史(P=0.642)均無顯著差異。兩組與患者的腫瘤分級存在相關(P=0.044)，提示miR-655的表達與OSCC腫瘤分級有關(表 1)。

表 1 miR-655表達與OSCC患者臨床特征的關系

2.3 miR-655與OSCC患者預后的關系

342 例OSCC患者隨訪時間為0.36～182.6 月(中位隨訪時間為21.3 月)。分析高、低表達組患者的總生存期，miR-655高表達患者總生存率優于低表達組(Log-rankP=1.19E-02)(圖 2)。Cox回歸分析提示：miR-655表達(HR：0.59，95% CI：0.53～0.95，P=0.020)、腫瘤分期和年齡是OSCC患者預后的獨立因素(表 2)。

圖 2 miR-655表達與OSCC患者總生存率的關系

表 2 OSCC預后因素的Cox回歸分析

2.4 PCR檢測miR-655在OSCC細胞的表達及轉染

qRT-PCR檢測miR-655在OSCC細胞的表達水平，結果示：miR-655在OSCC細胞中表達與人口腔上皮細胞HOK比較表達下調，其中CAL-27細胞表達水平明顯降低(t=5.074，P<0.001)，本研究選擇該細胞株進行后續實驗(圖 3A)。脂質體向CAL-27細胞轉染，設立miR-655 Mimics組、miR-655 NC組及脂質體處理的空白對照組，按CCK8檢測結果提示，轉染后第2天，miR-655 Mimics組CAL-27細胞的增殖能力較空白組和NC組顯著下降(P<0.001)(圖 3B)。

圖 3 miR-655在OSCC細胞中的表達及其轉染后的增殖影響

2.5 miR-655對OSCC細胞遷移及侵襲能力的影響

Transwell遷移及侵襲實驗結果提示，與空白組及NC相比，轉染Mimics的CAL-27細胞的遷移及侵襲能力減弱(圖 4)，差異具有統計學意義(P<0.001)。表明過表達miR-655可以明顯抑制CAL-27細胞的遷移及侵襲能力。

圖 4 miR-655轉染對CAL-27細胞細胞的遷移及侵襲能力的影響

3 討 論

OSCC是嚴重威脅人類健康的一類惡性腫瘤，由于OSCC早期難以診斷、進展快，導致其預后情況較差[9-10]。目前OSCC的發病機制，可能是涉及多條通路、多個基因調控、環境等導致的多種復雜生物學過程。miRNA作為調控功能的非編碼RNA，在腫瘤的發生及發展中，可作為腫瘤的潛在診斷及治療的生物標志物[11]。本研究通過挖掘OSCC高通量測序數據，發現miR-655在OSCC組織中呈低表達，并且高表達組miR-655的OSCC患者的腫瘤分級較好、預后優于低表達組，提示miR-655在OSCC中的抑癌作用。

目前關于miR-655對OSCC的臨床表達及預后，國內尚未見報道，但miR-655作為新報道的非編碼RNA，目前已有研究報道miR-655在一些腫瘤中低表達，呈抑癌基因的作用。Gajera等[12]研究報道了miR-497-5p和miR-655的表達通過調節人類非綜合征型唇腭裂的候選基因來抑制細胞增殖，提供了關于miRNA在非綜合征型唇腭病因中的作用的可能機制，并提出了診斷非綜合征型唇腭的可能策略。Zha等[13]的研究報道，miR-655可能通過調控VEGF的表達抑制卵巢癌細胞的增殖和侵襲，因此miR-655/VEGF途徑可作為卵巢癌患者的新型治療靶點。Oshima 等[14]研究提示將靶向腫瘤的miR-655與奧沙利鉑通過納米粒子的共同傳遞，抑制了肝癌的生長，提示通過使用腫瘤特異性納米粒子共同遞送microRNA和常規細胞毒劑，可以潛在地治療轉移性肝癌。本研究采用大數據挖掘發現miR-655在OSCC組織中呈低表達，并通過qRT-PCR驗證了miR-655在OSCC患者表達情況，與以上研究結果是相一致的，因此推測miR-655在OSCC具有抑制腫瘤的作用。在進一步分析中，首次探討了miR-655與OSCC患者的腫瘤分級及預后相關性，發現miR-655高表達患者總生存率明顯優于低表達組，與腫瘤分級負相關。Cox回歸分析提示miR-655表達水平是OSCC患者預后的獨立因素。有研究發現血漿中低水平的miR-655與淋巴浸潤和不良預后有關，血漿中miR-655水平的恢復可能抑制食管鱗狀細胞癌的淋巴進展，改善預后[15]。Zhao等[16]研究證實miR-655的低表達與肝癌患者的血管浸潤、腫瘤分級、淋巴進展顯著有關，為肝癌的獨立預后因素(HR=1.533, 95%CI:0.988-3.891;P=0.002)，可能為潛在的不利預后生物標志物。這些研究支持本研究的結果，表明了miR-655在OSCC中可能的預測價值。

目前miR-655在OSCC的具體作用機制，尚未見報道，這也是進一步研究的重點。本研究首次對miR-655在OSCC中可能的影響進行了初步的功能探討，結果提示，miR-655在OSCC細胞系中表達下調，過表達miR-655可以明顯抑制CAL-27細胞的增殖、遷移及侵襲能力，體外實驗證實了生物信息學分析的結果。相關研究證實miR-655通過直接靶向PAX6并抑制ERK和p38 MAPK信號通路來抑制視網膜母細胞瘤細胞的惡性生物學行為，以及通過調節肝細胞癌中的ADAM10和β-catenin途徑而發揮抑癌作用[17-18]。以上研究表明了miR-655在惡性腫瘤的可能作用機制，可能與磷酸化/去磷酸化調控及信號傳導分子的表達或活性抑制相關，進一步支持miR-655在OSCC中具有較大的生物學意義。

綜上所述，本研究結果提示miR-655在OSCC組織中呈低表達，與腫瘤病理分級有關，可作為其預后評估的潛在標志物，為OSCC的治療提供新的靶點，其作用機制可能與miR-655影響OSCC的增殖、遷移及侵襲能力有關。