HIF-1α RNAi對口腔鱗癌生長以及血管生成影響的研究

岑興 廖楚航 費偉 周昊

實體腫瘤生長的微環境通常是乏氧環境，這有利于細胞因子的釋放促進血管生成從而導致腫瘤的進程加快[1]。乏氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是乏氧環境中重要的信號傳導分子,它可以調控基因的表達產生一系列生物學效應促進腫瘤發展，包括血管生成、細胞增殖、凋亡、糖酵解和pH調節[2]。之前的研究發現，在多種腫瘤的生長和轉移中發現HIF-1α的異常表達，包括口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)[3-4]。

在本研究中，通過實時定量PCR(RT-PCR)、Western blot檢測了OSCC臨床標本中HIF-1α的mRNA和蛋白表達情況，使用RNA干擾(RNA interference,RNAi)下調HIF-1α在OSCC動物模型中的表達，觀察腫瘤生長情況，檢測HIF-1α和VEGF的表達水平，同時檢測了腫瘤細胞的凋亡情況和微血管密度(microvascular density,MVD)。初步探尋HIF-1α在OSCC發生和發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 腫瘤標本的檢測

實驗組標本來自四川省人民醫院頜面外科2019 年01 月～2019 年06 月手術切除的新鮮腫瘤組織(12 例)，年齡60～82 歲，所有患者病理證實均為OSCC；對照組為術中冰凍病理結果證實無腫瘤細胞浸潤的正常組織。所有患者均簽署知情同意書,本研究獲得四川省人民醫院倫理委員會的批準。

1.2 RT-PCR 檢測

取保存的腫瘤組織樣本12 例，分別磨碎后加入Trizol(50 mg 組織加入1 ml)抽提RNA，并用RevertAidTM試劑盒(Thermo，USA)逆轉錄成cDNA;取逆轉錄產物進行實時熒光定量RT-PCR(ABI Prism 7700，USA)。

1.3 Western blot檢測

使用蛋白提取試劑盒(北京索萊寶)提取腫瘤組織蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒(Pierce，USA)測定蛋白濃度。蛋白變性后，冷卻上樣，凝膠電泳半干法轉入PVDF膜后置于封閉緩沖液(搖床振蕩1 h)，分別加入目標基因一抗(1∶10 000，cell signaling technology，USA) ，4 ℃過夜，TBS/T洗滌后孵育二抗，ECL顯影條帶并進行灰度分析(Bio-Rad，USA) 。

1.4 IHC檢測

免疫組化染色過程按試劑盒所附說明進行，石蠟標本4 μm連續切片, 常規脫蠟;抗原修復; 加入HIF-1α抗體(北京中杉金橋)后，孵育1 h;加入二抗，孵育20 min;加入DAB溶液顯色，蒸餾水沖洗、復染、脫水、透明封片，電子顯微鏡下觀察采圖。

1.5 HIF-1α特異siRNA慢病毒載體的構建

表達HIF-1α特異siRNA慢病毒載體由上海生工生物工程技術服務有限公司合成包裝。

1.6 腫瘤模型建立以及RNAi體內實驗

口腔鱗狀細胞癌細胞株 Tca8113 購自四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室; 基本實驗步驟如下; 細胞株從液氮冰存中復蘇，培養于RPMI 培養液(15%滅活小牛血清，青霉素200 U/ml，鏈霉素200 U/ml)，37 ℃，5%CO2培養箱。收集對數生長期細胞，制備濃度為 1 ×107/ml 細胞懸液，皮下接種于30 只裸鼠背部，每個部位接種約0.1 ml。待腫瘤體積達到100 mm3，分別瘤內注射相同體積(0.1 ml)的生理鹽水(Mock組)，表達非特異性siRNA的質粒(pUc組)和表達HIF-1α特異siRNA的質粒(pU組)，每組10 只。每5天注射1 次，共注射4 次。從第5天開始，每5天用游標卡尺測量腫瘤體積，利用公式腫瘤體積=長徑×(短徑)2×1/2計算。最后1 次測量腫瘤體積后采用頸椎脫位法處死裸鼠，完整分離組織；一半組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋；另一半立即存放于液氮罐中，后轉存于-70 ℃冰箱，備后續檢測。

1.7 HIF-1α表達檢測

利用RT-PCR、Western blot和IHC檢測裸鼠瘤體內HIF-1α的表達變化，方法同1.2-1.4。

1.8 腫瘤細胞凋亡的測定

按照TUNEL試劑(碧云天，上海元業興生物科技有限公司)盒說明，對腫瘤組織中凋亡細胞進行測定。

1.9 VEGF的檢測和微血管計數

利用Western blot檢測VEGF的表達變化情況。CD34染色后，選擇2 個血管化程度較高的區域進行微血管計數，采用低光度數(×10物鏡)進行計數。最終的MVD值為每個高血管化區域(總面積：2.65 mm2)的3 個評價高倍視野(×25物鏡)的平均值。具有清晰管腔或明確線形血管形狀的血管被考慮用于計數。

2 結 果

2.1 腫瘤標本中HIF-1α的表達

結果顯示在OSCC患者腫瘤標本中HIF-1α的mRNA和蛋白的表達明顯高于對照組(P<0.05)(圖 1)。

圖 1 腫瘤組織和正常組織中HIF-1α的mRNA和蛋白的表達

2.2 HIF-1α抑制效果的檢測

PCR和Western blot結果顯示在注射了表達HIF-1α特異siRNA的移植瘤模型中，HIF-1α的mRNA和蛋白的表達明顯比對照組降低(P<0.05)(圖 2A)。

2.3 腫瘤生長的變化

腫瘤大體圖片示pU組瘤體的組明顯低于大小Mock組和pUc組(圖2 A)；生長曲線結果顯示pU組的生長趨勢明顯慢于其他組(P<0.05)(圖 2B)。

圖 2 荷瘤裸鼠腫瘤增長

2.4 HIF-1α的抑制效果

PCR、Western blot和IHC結果均顯示在pU組中HIF-1α的表達水平相對于Mock組和pUc組明顯降低(P<0.05)(圖 3)。

圖 3 3 組樣本中HIF-1α的mRNA、蛋白表達

2.5 腫瘤組織凋亡的變化

TUNEL結果顯示在pU組中，凋亡細胞的數量明顯要高于其他組(P<0.05)(圖 4)。

圖 4 3組腫瘤組織樣本中細胞凋亡(TUNEL)

2.6 VEGF表達和微血管密度變化

Western blot結果顯示在pU組中VEGF的表達顯著低于對照組(圖 5A)；同時，微血管密度(MVD)統計結果顯示，pU組中的MVD明顯低于對照組(P<0.05)(圖 5B)。

圖 5 腫瘤組織中VEGF的表達及MVD

3 討 論

癌癥目前被認為是由于基因的突變和異常表達導致的，這些基因的改變賦予細胞許多特定功能，如細胞增殖、生存、侵襲和轉移。因此，基因靶向治療可能成為控制癌癥進展的一種有效的方法。

實體腫瘤的生長很大程度上依賴于血管生成，腫瘤組織表現出比健康組織更低的氧合水平[1]。缺氧觸發了血管生成機制，HIF-1在這個過程中起了重要的作用，HIF-1是一種由HIF-1α和HIF-1β亞基組成的異源二聚體轉錄因子，當腫瘤細胞暴露在缺氧中時，它被穩定和激活，促進相關基因的轉錄，這些基因涉及腫瘤生物學的許多方面，包括血管生成、無氧能量代謝、細胞增殖、細胞侵襲和凋亡[5-6]。同時，多種腫瘤抑制蛋白和信號轉導途徑表達失調的結果也使HIF-1α轉錄活性增加。已在多種人類腫瘤中檢測到HIF-1α濃度升高，其表達水平與惡性程度和生存預后相關[3-4]。實驗結果也發現在OSCC患者的腫瘤組織中HIF-1α的表達明顯高于正常組織。

以往的研究揭示了HIF-1α參與腫瘤發展過程的生物學機制：首先，p53或VHL的丟失通過干擾其泛素化和蛋白酶體降解來增加HIF-1α蛋白的表達[7]；隨之，HIF-1α進入細胞核并與存在于促進對缺氧的生理反應的各種基因中的HRE結合，包括上調VEGF，以及糖酵解酶和葡萄糖轉運蛋白[8]，這些基因的上調通過增加腫瘤細胞中葡萄糖的供應和代謝來促進腫瘤的生長[9]，而VEGF由于其血管生成特性發揮了核心作用。Miele等[10]發現p42/p44MAPK通路在胰島素樣生長因子-1誘導的HIF-1α活化和VEGF中起重要作用。Lauhner等[11]的研究報道了HER2信號通過HIF-1a誘導VEGF基因的轉錄激活，這種激活依賴于PI3K和AKT的活性。在乏氧條件下，髁突軟骨細胞中HIF-1α和VEGF的表達成正相關[12]；另外，在人類導管原位癌和浸潤性乳腺癌中HIF-1α過表達與HER2、VEGF表達及MVD顯著相關[13]，HIF-1α功能喪失可抑制腫瘤血管生成，而HIF-1α功能增強可促進腫瘤血管生成[14]。與此相一致，研究結果表明，在體內外RNAi下調HIF-1α的表達時，VEGF的表達明顯受到抑制，并且在口腔鱗癌移植瘤中也同時發生了顯著的MVD抑制。因此，可以推測針對HIF-1α的RNAi可能通過下調血管生成因子(如VEGF)來阻止口腔腫瘤血管生成，從而阻止腫瘤的進程。

另一方面HIF-1α在癌癥的發展過程中還具有促進增殖和抗凋亡的作用。HIF-1α被證明在低氧誘導的胰腺癌細胞凋亡方面具有保護作用[15]。Yoshida等[16]發現HIF-1α可防止垂體腺瘤HP75細胞缺氧誘導的凋亡。Mizuno等[17]報道了RNAi介導的HIF-1α下調顯著抑制了肝膽和胰腺癌細胞的生長。另外，HIF-1α的一些靶基因也參與增殖因子和抗凋亡因子的形成，如VEGF、胰島素樣生長因子-2、血小板衍生生長因子和轉化生長因子-β，這些因子與其受體結合激活信號傳遞[18]。IAP-2是一種抗凋亡蛋白，也被認為是HIF-1α介導的候選因子[19]。實驗結果也表明，在HIF-1α被抑制之后，腫瘤在體內生長也受到抑制，凋亡細胞明顯增多，HIF-1α可能在刺激癌細胞增殖和抑制凋亡方面發揮關鍵作用。

綜上所述，RNAi下調HIF-1α的表達抑制了口腔鱗癌進展的許多關鍵步驟。為臨床上采用靶向HIF-1α技術治療OSCC，特別是防治癌細胞存活和血管生成方面提供了重要的理論依據和實驗基礎。