不同強度流體剪切應力作用下成骨細胞的形態學改變

岳二麗 李夏寧 趙紅宇

流體剪切應力(fluid shear stress，FSS)通過細胞表面不同信號通道將力學信號傳導到細胞內部，引起細胞發生一系列適應性改變，這是骨骼功能適應性的基本細胞學原理[1-2]。至今為止，生物應力作用下細胞形態學改變的研究尚較少，本研究擬采用精密的定常流加載系統對成骨細胞MG-63分別給予強度為7 dynes/cm2和12 dynes/cm2的FSS作用，通過觀察不同時間成骨細胞MG-63形態學的改變，從細胞動力學角度對種植體周圍骨重建的發生機理進行探討。

1 材料與方法

1.1 主要設備和儀器

清潔超凈臺(SW-CJ-IFD，蘇州凈化設備公司)；二氧化碳恒溫培養箱(BB15，Heraeus，德國)；倒置相差顯微鏡(CKX41，Olympus，日本)；臺式低速離心機(BS400，DENLEY)；純水制備系統(Rios 150，Millipore，美國)；定常流加載系統(MASTERFLEX蠕動泵系統，Fisher Scientific International Inc公司，美國)。

1.2 主要試劑

胎牛血清(FBS)、雙抗(青霉素100 U/L，鏈霉素100 μg/L)(Gibco公司,美國)；DMEM低糖培養基、0.25%胰蛋白酶&0.02%EDTA(Hyclone公司，美國)；PBS平衡鹽緩沖液(武漢博士德公司)；DMSO(Sigma公司，美國)。

1.3 主要試劑的配制

細胞完全培養液：DMEM培養基加體積分數為10%的FBS及1%～5%雙抗。

1.4 細胞培養

成骨細胞MG-63(四川大學華西口腔醫院)培養于完全低糖DMEM培養液[內含10%胎牛血清，1%～5%雙抗(青霉素100 U/L，鏈霉素100 μg/L)，pH 7.2]，置于CO2孵箱(37 ℃，5%CO2，95%空氣)，每隔2 d換1 次液。

1.5 細胞爬片制作

取對數生長期的MG-63細胞進行消化，制成單細胞懸液，細胞計數并調整細胞密度，以5×104/mL接種于已處理好的載玻片，加液，孵箱孵育2～4 h，備用。

1.6 成骨細胞性能鑒定

堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測定采用改良鈣鈷法(Gomori Ca-co法)；骨鈣素(bone glaproyein，BGP)測定采用免疫細胞化學SABC顯色法，操作步驟按試劑盒說明書進行。礦化結節染色采用茜素紅染色和鈣染色(Von Kossa染色)2 種方法。

1.7 流體加力條件優化

本研究采用定常流加載系統對MG-63細胞施加FSS，該系統包括流室、MASTERFLEX蠕動泵和儲液池等。FSS強度決定于液體流動速度并用公式σ=6μQ/H2W得出，其中μ(mPa.s)為粘滯系數，Q(mL/min)為單位時間內通過流室的液體體積，H為流室頂壁和置入載玻片表面的垂直距離。W為流室的寬度。DMEM培養基為細胞加載所用液體，粘滯系數經測定為0.86×10-2dynes.s/cm2。

1.8 細胞加力、染色和拍照

采用密閉流室加力系統，通過蠕動泵產生FSS。將細胞融合(約80%)鋪滿載玻片的細胞爬片置入密閉無菌流室的平行池槽，固定，對MG-63細胞進行7 dynes/cm2和12 dynes/cm2加力。作用時間分別為15、30、60和120 min。將細胞分為9 組，其中1組為對照組(同等條件培養但未加力)；余下8組分別施以不同強度不同時間的FSS作為實驗組，加力過程中保持應力大小穩定，加力結束后即刻收獲細胞。蘇木素(精)-伊紅染色，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態并照相。

1.9 統計學方法

2 結 果

2.1 成骨細胞性能檢測

MG-63細胞ALP染色、BGP免疫組化染色及礦化能力檢測均呈陽性(圖 1)。

圖 1 MG-63成骨細胞性能檢測

2.2 對照組MG-63的細胞形態

無剪切力作用的對照組MG-63細胞有梭形、三角形、球形和紡錘形等不規則的形態，偶見巨細胞、多核細胞及多極分裂相細胞，核質比較大，細胞核形狀不規則，核仁多，多為3～5 個，染色質呈顆粒狀，細胞質著色深且體積小，突起有多種形狀，如鋸齒狀或片狀(圖 2)。

圖 2 對照組MG-63成骨細胞(HE, ×400)

2.3 強度為7 dynes/cm2的FSS作用不同時間時的細胞形態比較(HE染色)

在生理負荷應力范圍內，隨著強度為7 dynes/cm2的FSS作用時間的增加(15、30和60 min)，細胞極性增強，細胞形態逐漸呈紡錘樣改變，細胞排列由原來雜亂不規則逐漸變規則，尤其是細胞長軸與剪切應力方向一致的細胞胞體被拉伸；胞核偏移，胞核分裂現象增加或核質比增大，表現出細胞增殖能力增強。當細胞加力時間為120 min時，細胞開始出現較多的細胞胞突，細胞形態不規則，核分裂相增多或核質比例變大，偶出現核邊集，凋亡等現象，胞漿內偶見空泡(圖 3)。

圖 3 7 dynes/cm2的FSS作用MG-63細胞不同時間時的細胞形態比較 (HE，×200)

用Image-pro plus圖像分析軟件對細胞照片進行處理，由圖 4可以看出隨著受力時間的延長，強度為7 dynes/cm2的FSS作用下細胞的形態變化不規則，但細胞面積均有增大的趨勢，并且與對照組(細胞平均面積為25 865.90±3 782.21)相比，應力作用30、60和120 min時(細胞平均面積為40 187.55±1 674.31、40 892.39±1 792.75和44 564.74±3 875.77)MG-63細胞面積均增加(P<0.05)，此時的應力刺激信號可誘導細胞形態變化。組間比較結果表明，應力作用0、15 min(細胞平均面積為27 974.90±2 758.49)時細胞面積變化無明顯差異(P>0.05)，且應力作用30、60與120 min時3 組之間細胞面積變化差異亦無統計學意義(P>0.05)。

圖 4 7 dynes/cm2的流體剪切應力作用下細胞面積比較

2.4 強度為12 dynes/cm2的FSS作用不同時間時的細胞形態比較(HE染色)

如圖 5，在強度為12 dynes/cm2的FSS作用下，隨著加力時間(0、15、30和60 min)增加，細胞極性改變，細胞形態由不規則逐漸向紡錘狀改變，細胞長軸改變明顯，細胞排列由原來雜亂無序逐漸變為規則排列。

圖 5 強度為12 dynes/cm2的FSS作用不同時間時的細胞形態比較(HE，×200)

其中，強度為12 dynes/cm2的FSS作用15 min和30 min時可觀察到細胞極性增強，細胞長軸與FSS方向一致的細胞胞體被拉伸，且有部分細胞胞突擺動的方向與應力方向趨于一致。當應力作用60 min時細胞骨架改變較明顯，細胞胞突增加，細胞形態規則性稍差，但細胞排列與應力方向的一致性較為明顯，細胞內出現明顯的胞核偏移，且受力細胞中核質比例增加明顯，約(1∶1～1.5∶1)胞核分裂相增加，表現出細胞增殖能力增強。當應力作用120 min時，細胞形態變化更為明顯，胞突增加，胞體膨脹或皺縮，可見較多細胞核出現核碎裂，核邊集，甚至出現細胞凋亡，細胞脫落現象。

用Image-pro plus圖像分析軟件對細胞照片進行處理，由圖 6可見，在強度為12 dynes/cm2的FSS作用下，隨著受力時間的延長，細胞的形態變化不規則，但直徑和面積均有增大的趨勢，并且與對照組(加力0 min)(細胞平均面積為25 865.90±3 782.21)相比，應力作用60 min和120 min時(細胞平均面積為42 248.61±1 425.53、49 025.22±2 174.47)細胞面積均增加(P<0.05)。組間比較結果表明：應力作用0、15、30 min時(細胞平均面積為31 916.79±8 053.22和28 657.32±1 145.16)細胞面積之間無明顯差異(P>0.05)；應力作用60 min和120 min時細胞面積之間差異亦無統計學意義(P>0.05)。

圖 6 12 dynes/cm2的流體剪切應力作用下細胞面積比較

2.5 強度為7 dynes/cm2和12 dynes/cm2的FSS分別作用不同時間時細胞平均面積比較

從圖 7可以看出，強度為7 dynes/cm2和12 dynes/cm2的FSS分別作用不同時間(15、30、60和120 min)時細胞面積平均值均有增加。用Image-pro plus圖像分析軟件檢測結果顯示：在相同作用時間段內，除在作用30min時兩種流速的FSS下細胞平均面積差異具有統計意義外(P<0.05)，其他時間兩種作用力下的細胞平均面積差異均無統計學意義(P>0.05)。

圖 7 不同FSS作用下MG-63細胞面積的比較

3 討 論

機械刺激誘導成骨細胞的正性調節對于骨的生成和修復具有至關重要的作用，而FSS是作用于骨組織的一種常見機械刺激。研究表明，FSS在細胞增殖、分化、基因表達和凋亡等過程中起著重要的作用[3-5]。在機械刺激的作用下，細胞整合素、第二信使系統和應力反應元件等做出響應，細胞骨架的構件通過重排分散了張力和壓力，最終導致細胞發生形變[6-8]。

表 1 7 dynes/cm2和12 dynes/cm2的流體剪切應力對MG-63細胞平均面積影響的比較

至今為止，機械應力作用下細胞形態學改變的研究尚較少。本研究所使用的定常流加載系統，是通過精密蠕動泵提供恒定的流體速度，以保證對成骨細胞施以可控的剪切應力。本次研究中分別對成骨細胞MG-63施以不同強度的FSS，運用HE染色相差顯微鏡觀察細胞形態發現：FSS可以促進成骨細胞形態發生改變，這些改變包括：細胞呈紡錘樣改變，細胞形態拉長，細胞表面胞突增多等，約有一半的細胞出現與應力方向一致的方向性改變。

MG-63起源于成骨細胞的前體或分化為成骨細胞的骨髓間充質干細胞，它是具有成骨細胞表性特征的一類特殊腫瘤細胞群體，其分化過程類似于成骨細胞[9-10]。研究證實MG-63是一種具有成骨細胞表性特征的標準成骨細胞，其生長過程與正常人成骨細胞一樣可分為細胞增殖、骨基質成熟和骨基質礦化階段。本研究中選用成骨細胞MG-63作為研究對象，并通過預試驗又一次對其成骨細胞特性做了印證，檢測發現MG-63細胞形態與成骨細胞相似，具有不規則外形、堿性磷酸酶活性和骨鈣素表達陽性的特點，而且體外培養MG-63約3～4 周時可觀察到礦化結節形成。

近年來已有許多學者對機械應力作用下的成骨細胞增殖數目及相關基因蛋白表達的變化進行了研究并取得了一定的成果，但應力的大小和作用時間對細胞的生物學行為及細胞形態學變化的影響等尚不明確[11-13]。通過反復調試觀察并結合相關文獻，本實驗選擇兩種強度(7 dynes/cm2和12 dynes/cm2)的FSS作用，以4 個時間段(15、30、60和120 min)分組，觀察不同強度的FSS在不同作用時間下成骨細胞的形態及面積改變。該實驗發現成骨細胞對不同強度的FSS信號的敏感性不同，并且同一FSS作用時間不同成骨細胞的形態的改變亦不同。與強度為7 dynes/cm2的FSS相比，強度為12 dynes/cm2的FSS對成骨細胞形態具有明顯的影響；并且加力時間不超過60 min時，強度為12 dynes/cm2的FSS對細胞的促進增殖和分化作用更為明顯，其中，強度為12 dynes/cm2的FSS對成骨細胞作用60 min時，應力對細胞形態影響較大，細胞核分裂增殖最為明顯。FSS作用下成骨細胞形態發生了適應性變化[14-16]，可能改變成骨細胞的細胞骨架、微管及微絲重新排列、微管極性改變等，目的在于促進應力部位的骨形成，相對較少骨吸收。而細胞排列改變是因為細胞長軸與剪切應力方向一致能使細胞受到的應力降低，減少對流體的阻力，有利于細胞更好地維護自身的生理功能，此能力可能與成骨的方向有關。

該實驗結果為進一步探索FSS大小、作用時間與細胞增殖、分化和凋亡的量效及時效關系提供了依據，并且從細胞形態學方面為探討FSS作用下力學信號在種植體細胞界面的轉導機制提出了新思路。