靈芝乙醇提取物上調Syk抑制胰腺癌細胞SW1990增殖、遷移和侵襲的研究

王海 徐幸幸 馬海 彭勇

胰腺癌是人類最惡性的實體瘤之一，其特征在于診斷晚，進展快，早期轉移和化學耐藥性。盡管近年來使用了越來越多的療法，包括手術切除，化學療法和放射療法，但患者總體5年生存率仍<5%[1,2]。因此，迫切需要開發新的診斷和治療策略，并闡明相關的分子機制，以提高胰腺癌的診斷準確性和臨床治療。靈芝系多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子實體，具有補氣安神，止咳平喘的功效，用于心神不寧，失眠心悸，肺虛咳喘，虛勞短氣，不思飲食[3]。研究發現，靈芝乙醇提取物具有抑制胰腺癌、肺癌、宮頸癌等肝癌、胃癌、乳腺癌細胞增殖的作用，表現出一定的抗腫瘤效果[4]。臨床資料表明，靈芝提取物對胰腺癌[5]的治療效果滿意，可以延長生存期，提高患者生活質量。但是，靈芝乙醇提取物對胰腺癌細胞遷移和侵襲的功能與分子機制仍不清楚，生物標志物在腫瘤治療中的應用尚需進一步驗證。脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，Syk)此前被證明在胰腺癌中低表達，能夠抑制胰腺癌的生長和轉移[6,7]。但是Syk是否參與靈芝乙醇提取物影響胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲過程尚未可知?；诖?，本研究考察不同濃度的靈芝乙醇提取物對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并通過Syk基因探索其潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 靈芝乙醇提取物(黃色粉末，含量為63.77 g/g生藥，成都榮保生物科技開發有限公司)，胰腺癌細胞SW1990(美國典藏培養物保存中心)，Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培養基(美國Thermo Fisher Scientific公司)，Lipofectamine 2000試劑(美國Invitrogen公司)，Syk過表達質粒pcDNA3.1-Syk、過表達空載質粒pcDNA3.1(上海GenePharma公司)，細胞核相關抗原Ki67(Nuclear associated antigen Ki67，Ki67)小鼠單克隆抗體、上皮型鈣黏附蛋白(E-cadherin)小鼠單克隆抗體、神經型鈣黏附蛋白(N-cadherin)小鼠單克隆抗體及Syk小鼠單克隆抗體、HRP標記的山羊抗鼠IgG二抗(英國Abcam公司)。

1.2 細胞培養 細胞SW1990在RPMI 1640培養基中(10%胎牛血清、100 mg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素)培養，并在37℃、5% CO2的培養箱內生長。

1.3 細胞分組與處理 將對數生長期的細胞SW1990分為以下幾組：對照組(未給予藥物)，低劑量藥物組(給予25 μg/ml靈芝乙醇提取物)，中劑量藥物組(給予50 μg/ml靈芝乙醇提取物)，高劑量藥物組(給予100 μg/ml靈芝乙醇提取物)，pcDNA3.1組(轉染pcDNA3.1)，pcDNA3.1-Syk組(轉染pcDNA3.1-Syk)，高劑量藥物組+pcDNA3.1組(轉染pcDNA3.1并給予100 μg/ml靈芝乙醇提取物)，高劑量藥物組+pcDNA3.1-Syk組(轉染pcDNA3.1-Syk并給予100 μg/ml靈芝乙醇提取物)。其中，靈芝乙醇提取物作用時間為48 h。在進行細胞轉染時，根據制造商的說明，使用Lipofectamine 2000試劑將pcDNA3.1-Syk、pcDNA3.1質粒轉染到40%～50%匯合狀態的SW1990細胞。轉染24 h后，使用不同濃度的靈芝乙醇提取物處理。

1.4 MTT比色法檢測細胞存活 收集不同處理的細胞SW1990，按1×105個/ml的密度接種于96孔板。培養48 h后，加入5 mg/ml的MTT溶液，每孔20 μl，37℃孵育4 h，加入二甲基亞砜150 μl，劇烈振蕩10 min以溶解結晶。之后于酶標儀檢測490 nm波長處的細胞吸光度(OD)值，按照公式計算細胞存活率(%)，細胞存活率(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.5 平板克隆測定細胞克隆形成 將不同處理的細胞SW1990接種到6孔板中，每孔5×102個細胞。將細胞培養2～3周。當肉眼可見細胞集落時，終止細胞培養，將SW1990細胞用4%多聚甲醛固定，Giemsa染色10～30 min，并在顯微鏡下統計細胞克隆形成數。

1.6 Transwell小室法評估細胞遷移和侵襲 侵襲測定：用無血清RPMI 1640培養基將SW1990細胞調整至1×106個細胞/ml，取200 μl細胞置于Matrigel 預涂的Transwell上室中，并在下室添加600 μl含20%胎牛血清的RPMI 1640培養基。培養48 h后，將Transwell膜用4%多聚甲醛固定，用結晶紫染色10 min，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次。在顯微鏡下觀察侵襲膜的細胞數目。遷移測定：Transwell上室不涂Matrigel，其余步驟相同。

1.7 免疫印跡實驗(western blot)分析Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Syk表達 將SW1990細胞在冷RIPA緩沖液中裂解，然后用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，然后將其轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。之后，將PVDF膜在5%脫脂奶粉中一起于4℃孵育3 h。然后，將膜與一抗在4℃孵育過夜，然后與二抗在37℃孵育1 h。使用ECL檢測免疫復合物。通過Image-Pro軟件分析相對蛋白表達，并將GAPDH用作內參。

2 結果

2.1 靈芝乙醇提取物對SW1990細胞增殖的影響 與對照組相比，低、中、高劑量藥物組的細胞存活率明顯減少，克隆形成數顯著降低，二者均呈劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 靈芝乙醇提取物對SW1990細胞增殖的影響

2.2 靈芝乙醇提取物對SW1990細胞遷移侵襲的影響 與對照組相比，低、中、高劑量藥物組細胞的遷移細胞數和侵襲細胞數均明顯減少，并呈劑量依賴性(P<0.05)。見表2。

表2 靈芝乙醇提取物對SW1990細胞遷移侵襲的影響 個,

2.3 靈芝乙醇提取物對SW1990細胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Syk表達的影響 與對照組相比，低、中、高劑量藥物組SW1990細胞中Ki67蛋白表達水平明顯降低，E-cadherin蛋白表達水平顯著升高，N-cadherin蛋白表達水平明顯減弱，Syk蛋白表達水平顯著增強，且均呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖1，表3。

圖1 靈芝乙醇提取物對SW1990細胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Syk蛋白表達的影響

表3 靈芝乙醇提取物對SW1990細胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Syk表達的影響

2.4 Syk對靈芝乙醇提取物作用的SW1990細胞增殖遷移侵襲的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-Syk組、高劑量藥物+pcDNA3.1組、高劑量藥物+pcDNA3.1-Syk組的細胞存活率明顯減少，克隆形成率顯著降低，遷移細胞數明顯減少，侵襲細胞數顯著降低(P<0.05)。高劑量藥物+pcDNA3.1-Syk組SW1990細胞的細胞存活率、克隆形成數、遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著低于pcDNA3.1-Syk組或高劑量藥物+pcDNA3.1組(P<0.05)。見表4。

表4 Syk對靈芝乙醇提取物作用的SW1990細胞增殖遷移侵襲的影響

2.5 Syk對靈芝乙醇提取物作用的SW1990細胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Syk表達的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-Syk組、高劑量藥物組+pcDNA3.1組、高劑量藥物+pcDNA3.1-Syk組細胞中Ki67蛋白表達水平明顯降低，E-cadherin蛋白表達水平顯著升高，N-cadherin蛋白表達水平明顯減弱，Syk蛋白表達水平顯著增強(P<0.05)。與pcDNA3.1-Syk組或高劑量藥物+pcDNA3.1組相比，高劑量藥物+pcDNA3.1-Syk組SW1990細胞的Ki67蛋白表達水平明顯降低，E-cadherin蛋白表達水平顯著升高，N-cadherin蛋白表達水平明顯減弱，Syk蛋白表達水平顯著增強(P<0.05)。見表5，圖2。

圖2 Syk對靈芝乙醇提取物作用的SW1990細胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達的影響

表5 Syk對靈芝乙醇提取物作用的SW1990細胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Syk表達的影響

3 討論

癌癥轉移是惡性腫瘤的特征之一，是大多數癌癥患者死亡的主要原因。癌癥轉移包括許多相互依存的過程，如癌細胞不受控制的生長，向周圍組織的侵襲，向身體遠處的遷移以及其他器官的定植[8]。其中，腫瘤細胞遷移是轉移的先決條件，腫瘤細胞參與遷移和侵襲過程以促進腫瘤進展和轉移。因此，靶向腫瘤細胞運動性已在癌癥治療中引起了極大的關注[9]。靈芝是一種具有顯著[10]的抗腫瘤作用的中草藥，可以改善胰腺癌[5]和肝癌患者的生活質量。在本項研究中，以胰腺癌細胞SW1990為研究對象，以評估靈芝乙醇提取物對胰腺癌的治療效果。結果表明，靈芝乙醇提取物可以有效抑制SW1990細胞的生長和轉移。值得注意的是，本研究揭示了Syk基因介導靈芝乙醇提取物抗胰腺癌細胞增殖和轉移的過程，本研究提供了有關了解靈芝乙醇提取物治療腫瘤進展效果的有用信息。

靈芝是一種藥用真菌，自古以來，它已被用于預防和治療各種疾病，例如慢性肝炎，腎炎，高血壓，支氣管炎和致瘤性疾病[11]。越來越多的研究報告稱，靈芝可以顯著抑制多種癌癥的發生，侵襲和轉移，包括結腸癌[12]，肺癌[13]和白血病[14]，此外，靈芝可以保護肝臟，幾乎沒有毒性，并且可以減少化學療法對正常細胞的毒性[15]，這些使得靈芝成為抗癌的有希望的潛在治療和化學預防候選藥物。研究表明，靈芝提取物可以抑制乳腺癌細胞的活力、遷移和侵襲能力[8]，靈芝多糖可以減弱宮頸癌細胞的侵襲和遷移能力，促進宮頸癌細胞的凋亡并限制細胞周期，并且伴隨著E-cadherin表達的增加和N-cadherin表達的減少[16]。在本項研究中，結果顯示，25、50、100 μg/ml劑量的靈芝乙醇提取物可以抑制胰腺癌細胞SW1990的存活、克隆形成、遷移和侵襲能力，并降低Ki67和N-cadherin蛋白表達，提高E-cadherin蛋白表達，均呈現一定的劑量依賴性，這表明靈芝乙醇提取物在胰腺癌中具有抗腫瘤活性，與前人報道[4,8,13]一致。

Syk是一種細胞質非受體酪氨酸激酶，在多種造血細胞中廣泛表達。在癌癥中，Syk與細胞遷移，淋巴血管浸潤，微血管密度和/或轉移形成之間也存在相關性[17]。一些研究表明，Syk在癌癥中具有雙重作用，在白血病中，Syk是眾所周知的癌基因和腫瘤啟動子[18]。相反，在乳腺癌中，它被認為是腫瘤抑制因子[19]。SyK的抑制可顯著降低卵巢腫瘤細胞的侵襲性[20]和阻止神經膠質瘤細胞的增殖，遷移和菌落形成[21]。另一些資料顯示，Syk在乳腺癌和其他癌中的表達降低與存活率降低和轉移風險增加相關，Syk表達的增加增強了E-cadherin/catenin的磷酸化和穩定化，從而抑制細胞遷移和侵襲[22]。在胰腺導管腺癌中，syk被確定為腫瘤分化/抑制因子的標志，通過調節胰腺導管腺癌細胞生長和侵襲作為腫瘤抑制劑[23]。本實驗檢測到了與乳腺癌[22]、胰腺導管腺癌[23]相同的結果，Syk過表達明顯減少胰腺癌細胞的細胞存活率、克隆形成率、遷移細胞數、侵襲細胞數、Ki67、N-cadherin蛋白表達水平，顯著增加E-cadherin蛋白表達水平，為Syk作為胰腺癌腫瘤抑制因子提供了新的證據。

盡管靈芝及其提取物在腫瘤治療方面的益處已被廣泛報道，但其抗腫瘤的機制仍有待于闡明。Wang等[24]學者揭示了，程序性細胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)是靈芝介導的免疫調節的重要靶標，靈芝可能通過減少PD-1蛋白和增強免疫反應(例如T細胞浸潤)來調節免疫反應，以抵抗疾病的發展，例如腫瘤的生長。Wu等[25]首次報道了靈芝多糖可能促進人前列腺癌細胞凋亡的過程，該過程部分是通過非甾體類抗炎藥激活基因-1(Non-steroidal anti-inflammatory drug-activated gene-1，NAG-1)誘導介導的。本研究進一步評估靈芝乙醇提取物抗胰腺癌的分子機制，發現低、中、高劑量的靈芝乙醇提取物以劑量依賴方式促進Syk的蛋白表達，提示Syk基因可能與靈芝乙醇提取物治療癌癥有關。另外，本研究還觀察到，Syk過表達后，靈芝乙醇提取物對SW1990細胞存活、克隆形成、遷移、侵襲、Ki67、N-cadherin蛋白表達的抑制作用被增強，且靈芝乙醇提取物對細胞E-cadherin蛋白表達的促進作用也被增強。這些結果證實，上調Syk基因是靈芝乙醇提取物發揮胰腺癌抑制作用的重要途徑之一。

總之，本研究表明，靈芝乙醇提取物能夠以劑量依賴方式抑制胰腺癌細胞SW1990的增殖、遷移和侵襲，并且，Syk基因的上調可以增強靈芝乙醇提取物的這些功能。本研究確定了Syk為靈芝乙醇提取物抗胰腺癌增殖和轉移的分子靶標，這可能為靈芝作為胰腺癌和其他癌癥類型的抗癌藥提供一種新思路。