鎘脅迫對大豆細胞周期G2/M阻滯調控的影響

曹霞，王春雷，李志剛，崔天宇，王曉東

（1.內蒙古民族大學 農學院，內蒙古 通遼028043；2.通遼市農牧業科學研究所，內蒙古 通遼028000）

大豆（Glycine max）起源于中國，是全球主要栽培的農作物之一，栽培大豆是野生大豆（G.soja）經歷了5 000多年的時間馴化而來的［1］，截止到目前，在大豆重要農藝性狀方面，關于基因克隆和基因功能解析等已有較多研究［2-5］.隨著工業的迅速發展，我國土壤受重金屬污染日趨嚴重，其中最為明顯的是鎘（Cd）污染，有研究發現，Cd對植物的毒害效應在很多方面都有表現，例如抑制種子萌發、影響細胞分裂、幼苗生長、植物的代謝（如水分代謝、礦質營養、光合與呼吸等）、破壞活性氧的防御系統等［6-8］.鎘脅迫還會導致大豆葉片畸形、變黃，莖稈、葉脈和葉片呈紅褐色，植株矮化、莖稈纖細、生長緩慢、枯萎死亡.ANDRES等［9］和SCEBBA等［10］研究指出，鎘脅迫不僅能引起大豆基因組DNA甲基化水平和模式的改變［11］，還對基因產生毒性.LIU等［12］和吳慶鈺等［13］研究分別指出，隨著Cd濃度的增加，大麥根尖基因組DNA的RAPD圖譜（包括RAPD譜帶的缺失、增加及其熒光強度）和水稻葉片DNA的損傷均發生顯著變化，這些變化可能直接或間接與細胞周期的調控機制有關.到目前為止，有關細胞周期調控機制的報道很少，大部分研究集中在各種目標基因功能的鑒定及表達，如CIPK基因［14］、GmMP基因［15］、Gm DAO1基因［16］，或者是基因家族全基因組的鑒定和分類，如OSCA基因家族［17］、KUP/HAK/KT鉀轉運體基因家族［18］、DNA甲基化酶的分析［19］等，而ROBERT等［20-21］研究表明，Cd脅迫引起大豆懸浮液細胞周期基因CyclinB1和CDK-A的表達差異，導致DNA損傷，細胞周期阻滯期發生在G1/S期和G2/M期，但是對于其損傷反應和細胞周期阻滯調控機制尚不清楚，而DNA錯配修復系統中MSH2和MSH6蛋白能夠識別由Cd脅迫引起擬南芥DNA損傷，并參與細胞周期調控，那么在大豆中是否也是如此，目前鮮見報道.本試驗選取2個對Cd有不同耐性的品種，分析Cd脅迫對大豆細胞周期阻滯調控的影響，研究細胞周期阻滯發生的時期和相關基因表達的相關性，以期為大豆抗性育種、遺傳改良育種提供潛在的基因突變風險評估.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料由沈陽農業大學大豆研究所提供，分別為“遼豆10號”（對Cd敏感）和“沈農豆20”（對Cd頓感）.

1.2 試驗設計

采用培養皿雙層濾紙培養法.Cd濃度分別設為0、0.25、0.50和2.50 mg·L-1等4個梯度，每個濃度重復5次，共40個處理；放置于光照培養箱里25±1℃培養4 d，光周期為16 h/8 h.

1.3 測定指標及方法

1.3.1 幼苗形態指標測定及方法

取不同Cd濃度處理下的大豆幼苗，觀察發芽情況，計算發芽率；分別測量其根長、鮮重，計算根長抑制率，公式如下：n=（1-x/y）×100%（式中，x為各處理組幼苗初生根平均根長；y為對照組幼苗初生根平均根長）.

1.3.2 細胞周期測定及方法

取不同Cd濃度處理后的幼苗，剪取根尖（約0.5 cm），用濾紙吸干水分后放入盛有200 μL細胞核解離液的培養皿中，迅速用鋒利的刀片將其切碎，轉移到2 mL的離心管中，室溫下靜置5~10 min，然后過50 μm和30 μm的尼龍篩，向濾液中加入解離液體積1.4倍的DAPI（Partec，Germany）染液，室溫下暗處放置30~45 min，然后采用倍性分析儀CyFlow flow cytometer（Partec，Germany）在365 nm波長處進行測定.

測定結果使用Flowjo 10 win 64 software（BD Biosciences，San Jose，CA）進行分析.

1.3.3 大豆幼苗根尖RNA提取和qRT-PCR測定及方法

（1）總RNA提?。翰捎肦NA提取試劑盒，名稱為EZ-10DNAaway RNA Mini-prep Kit，用蛋白質核酸分析測定儀測定OD260/OD280和OD260/OD230的比值來確定所提取RNA的純度，并用1%的普通瓊脂糖凝膠電泳在120～130 V的電壓下快速電泳檢測RNA的完整性.

（2）RNA反轉錄cDNA：采用cDNA試劑盒，名稱為PrimeScriptTM 1st strand cDNA Sythesis kit.

（3）PCR擴增體系采用SYBR Green Mix：20 μL反應體系為SYBR（緩沖液）10 μL，RF（引物）2 μL，cDAN模板量1 μL，無菌水7 μL.

（4）PCR擴增流程：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，75℃退火5 s，40個循環，60℃延伸10 min.

每個反應結束后采集熒光，每個處理做3個重復，并建立實時擴增曲線和溶解曲線.上述基因轉錄水平變化的計算公式為：2-△△Ct，其中，△△Ct=（Ct target-Ct control）Sample2-（Ct target-Ct control）Sample1.以大豆UBQ10基因為內參基因，所用引物序列見表1.PCR擴增后用QPCR分析數據模板進行基因表達的變化規律分析.

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.3.4 根尖DNA提取及RAPD測定

（1）DNA提取采用新型植物基因組DNA提取試劑盒（CW0531）（北京康維世紀生物科技有限公司）提取幼苗根尖全基因組DNA.使用核酸蛋白儀測定其純度及含量，用1%瓊脂糖凝膠電泳及Takara DL2000 DNA Marker進行含量校準及其完整性檢測.

（2）RAPD分析方法參照LIU等［23］和李珊珊［24］，引物選用Primer 3和Primer 11（表2）.

表2 試驗中使用的2種隨機引物序列Tab.2 Two random primer sequences used in the experiment

1.4 數據處理分析

采用SPSS軟件（版本20.0）和Microsoft Excel 2003進行數據統計分析.

2 結果與分析

2.1 Cd脅迫對大豆幼苗根長生長的影響

與對照組相比，遼豆10號處理組的鮮重除了在Cd濃度為2.50 mg·L-1時達到了顯著性差異（P<0.05）外，其他均無顯著差異，發芽率均無顯著差異，而沈農豆20處理組的發芽率和鮮重均沒有達到顯著性差異；與對照組相比，遼豆10號和沈農豆20處理組的根長均達到了顯著性差異（P<0.05）；遼豆10號的根長+胚軸在Cd濃度為0.50和2.50 mg·L-1時達到了顯著性差異（P<0.05），而沈農豆20則是在Cd濃度為0.25 mg·L-1達到了顯著性差異（P<0.05）；在Cd濃度為0.25 mg·L-1時遼豆10號和沈農豆20均表現為促進作用，其抑制率分別為-13.42%和-15.67%，在0.50 mg·L-1和2.50 mg·L-1Cd處理下遼豆10號和沈農豆20均表現為抑制作用，抑制率分別為25.92%、54.21%和19.52%、23.64%，根長與Cd水平呈明顯的倒U字型—劑量關系（表3），說明遼豆10號較沈農豆20對Cd毒性更敏感.

表3 Cd脅迫對大豆發芽率、根長、鮮重的影響Tab.3 Effects of Cd stress on germination，root length，and fresh weight of soybean

2.2 Cd脅迫對大豆根尖細胞周期阻滯調控的影響

遼豆10號在Cd脅迫下其根尖細胞核DNA含量分布比例在2C（細胞核內有2組DNA）水平呈遞增變化，DNA含量比例的增加量達5%~50%，4C（4個組DNA數目）呈遞減變化，均有顯著性差異（P<0.05），而8C（8個組DNA數目）水平DNA含量分布比例無顯著變化，說明在Cd脅迫下遼豆10號（敏感型）幼苗根尖細胞周期是被阻滯在G1/S期（圖1a）；沈農豆20根尖細胞核DNA含量分布比例在2C水平呈遞減變化，4C呈遞增變化，且DNA含量比例的增加量達13%~18%，而8C水平DNA含量分布比例同樣沒有達到顯著性差異，說明沈農豆20（鈍感型）幼苗根尖細胞周期是被阻滯在G2/M期（圖1b）.試驗結果表明，在受Cd脅迫后，對重金屬Cd耐性不同的品種，其細胞周期阻滯的時期也不相同，這可能與品種本身對Cd脅迫應答反應機制及抵御脅迫機制不同有關.

圖1 FCM流式細胞術對Cd（0~2.50 mg·L-1）處理4 d后的大豆根尖細胞核DNA含量分析Fig.1 Analysis of nuclear DNA content in root tips of soybean seeds Liaodou 10 and Shennongdou 20 treated with CD（0~2.50 mg·L-1）for 4 d by FCM flow cytometry

2.3 與細胞周期相關基因的qRT-PCR表達分析

2.3.1 Cd脅迫影響大豆幼苗根尖細胞周期G2/M期相關基因表達

遼豆10號細胞周期G2/M期相關的基因表達呈遞減的變化趨勢，CYCB1；1、WEE1和CyclinB基因的表達量隨著Cd濃度的增加呈下調變化趨勢，除了WEE1基因的0.25 mg·L-1Cd處理外，其他處理達到了顯著或極顯著差異（P<0.05或P<0.01），其中，在2.50 mg·L-1Cd處理下，CYCB1；1、WEE1和CyclinB基因的表達量分別較對照組下調了0.749、0.878和0.564（圖2a）；沈農豆20的細胞周期G2/M期相關的基因表達與遼豆10號呈現不同的變化趨勢，與對照組相比，CYCB1；1、WEE1和CyclinB基因的表達量在0.25 mg·L-1Cd脅迫下顯著增加，達到極顯著性差異（P<0.01），其增加量分別是對照組的1.6倍、5.5倍和1.5倍，隨著鎘濃度的增加，其表達量顯著降低，整體來看，隨著Cd脅迫濃度的增加，CYCB1；1、WEE1和CyclinB基因的表達量呈典型的倒U型，與遼豆10號對照組相比，在0~2.50 mg·L-1Cd處理下CYCB1；1、WEE1和CyclinB基因的表達量均顯著降低，0~0.50 mg·L-1Cd處理下降低量在對照組0.107~0.723之間，而在2.50 mg·L-1Cd處理下，CYCB1；1、WEE1和CyclinB基因的表達量分別降低到對照組的0.052、0.071和0.187（圖2b）.試驗結果表明，Cd脅迫下沈農豆20根尖DNA損傷修復能力較遼豆10號強，其中有一部分參與G2/M期阻滯.

圖2 Cd脅迫4 d后對大豆幼苗根尖細胞周期相關基因轉錄水平表達的影響Fig.2 Effect of Cd stress on cell cycle related gene expression in root tips of soybean seedling after 4 d

2.3.2 Cd脅迫影響大豆幼苗根尖DNA損傷相關基因表達

關于DNA損傷修復基因RAD51、MRE11和KU70的表達量，遼豆10號和沈農豆20表現出相似的變化規律，即除了沈農豆20的RAD51基因之外，基因RAD51、MRE11和KU70的表達量與Cd濃度呈典型的倒U型劑量-效應關系，在0.25 mg·L-1Cd脅迫下，遼豆10號和沈農豆20較對照組均增加，增加量為1.4~2.0倍.隨著Cd濃度的增加，遼豆10號表達量均受到抑制，呈下調趨勢，在2.50 mg·L-1Cd時均達到極顯著性差異（P<0.01），其中，RAD51和MRE11基因的表達量僅為對照組的0.108和0.288（圖3a）.而沈農豆20的RAD51基因表達量隨Cd濃度的增加呈遞減變化趨勢，下調比例在0.2~0.8之間，MRE11和KU70基因表達量則呈典型的倒U型，在0.25~0.50 mg·L-1Cd時表現為增加，達到了顯著性差異；與遼豆10號對照組相比，RAD51基因的表達量在0 mg·L-1Cd時表現為增加，但無顯著差異，隨著Cd濃度（0.25~2.50 mg·L-1）的增加其表達量均表現為下降；MRE11基因的表達量隨著Cd濃度（0.25~2.50 mg·L-1）的增加表現為上調，KU70基因的表達量隨著Cd濃度（0.25~2.50 mg·L-1）的增加表現為先上調后下調的變化，上調量是對照組的1.4~1.9倍（圖3b）；試驗結果表明，Cd脅迫對遼豆10號和沈農豆20幼苗根尖細胞DNA均能夠造成嚴重的損傷，主要包括非同源末端連接（NHEJ）和同源重組（HR），并且有一部分參與細胞周期阻滯.

圖3 Cd脅迫4 d后對大豆幼苗根尖DNA損傷修復基因轉錄水平表達的影響Fig.3 Effects of Cd stress on DNA damage repair genes expression in root tips of soybean seedling after 4 d

2.3.3 Cd脅迫影響大豆幼苗根尖MMR相關基因表達

遼豆10號DNA錯配修復基因MLH1、MSH2和MSH6的表達量隨Cd濃度的增加均表現為下調，且達到顯著性差異，在2.50 mg·L-1Cd處理下，基因MLH1、MSH2和MSH6的表達量下調分別僅為對照組的0.191、0.128和0.261（圖4a）.沈農豆20的DNA錯配修復基因MLH1和MSH6基因的表達量在0.25~2.50 mg·L-1Cd濃度脅迫下與對照組相比均表現為下調；而MSH2基因的表達量與Cd濃度呈典型的倒U型劑量-效應關系，在0.25 mg·L-1Cd時上調量為1.11倍，在0.50~2.50 mg·L-1Cd時MSH2和MSH6基因的表達量下調達到極顯著差異，其中，MSH2基因下調到對照組的0.342和0.123，而MSH6基因下調到對照組的0.112和0.085；與遼豆10號對照組相比，MLH1基因的表達量在0~2.50 mg·L-1Cd脅迫下均顯著降低，其中，在2.50 mg·L-1Cd濃度處理下調量僅是對照組的0.204，MSH2基因表達量在0.25 mg·L-1Cd時上調了約1.3倍，0.50~2.50 mg·L-1Cd時，MSH2和MSH6的表達量均顯著降低，且在2.50 mg·L-1Cd時達到最小，僅為對照組的0.14（圖4b）.試驗結果表明，Cd脅迫都能引起遼豆10號和沈農豆20根尖細胞DNA的損傷，但是在2個品種間這些基因的表達量達到顯著差異，說明Cd脅迫對不同的品種造成DNA損傷類型是不同的.

圖4 Cd脅迫4 d后對大豆幼苗根尖DNA錯配修復基因轉錄水平表達的影響Fig.4 Effects of Cd stress on DNA mismatch repair genes expression in root tips of soybean seedling after 4 d

2.4 Cd脅迫對遼豆10號和沈農豆20基因組DNA多態性（RAPD）分析

與對照組相比，在0.25 mg·L-1Cd脅迫下，遼豆10號和沈農豆20幼苗根尖中可檢測出的條帶數分別為5和11.5，達到顯著差異，在0.50 mg·L-1Cd脅迫下，遼豆10號和沈農豆20幼苗根尖中可檢測出的條帶數分別為6.5和13，在2.50 mg·L-1Cd脅迫下，可檢測出的條帶數分別為8和17（圖5）.試驗結果表明，中低濃度的Cd處理就已經對基因組DNA造成了一定的損傷，而高濃度Cd處理對基因組DNA造成的則是直接性損傷，這種損傷很難修復，從而增加了基因組的不穩定性.Cd脅迫下RAPD圖譜中遼豆10號和沈農豆20檢測到不同的多態性條帶數，說明遼豆10號DNA損傷不會導致繼發性的形成；而沈農豆20的DNA損傷程度顯著高于遼豆10號，說明沈農豆20幼苗根尖DNA損傷可能會有級聯反應，說明Cd脅迫下誘導遼豆10號和沈農豆20細胞周期阻滯存在基因型差異.

3 討論與結論

鎘脅迫對植物有不同的損害，在生理生化方面表現在葉綠素的合成和光合作用、細胞生長，碳、水、營養物質的轉換和吸收等方面［11，25］；同時鎘還會破壞細胞內營養物質穩定性，比如鈣穩態、激活蛋白激酶C、誘導氧化脅迫引起細胞周期阻滯［25-26］.鎘還可以造成DNA單、雙鏈斷裂、堿基錯配、堿基插入/丟失及DNA鏈內和鏈間相互交聯、序列改變、甲基化損傷等.DNA損害后有2種選擇，一種是修復，另外一種是凋亡，前者是細胞周期檢查點監測到DNA損傷并被激活，細胞周期停滯，通過運行各種途徑修復細胞，以及在修復損傷后細胞周期恢復；后者是損傷太嚴重無法修復最終走向死亡［27-28］.本試驗結果表明，不同的Cd濃度暴露均能引起大豆幼苗根尖DNA的損傷，造成基因組的不穩定性，Cd處理后遼豆10號細胞周期阻滯在G1/S期，而沈農豆20則是阻滯在G2/M期，說明由Cd誘導的細胞周期阻滯在這2個品種之間存在基因型差異，從而對Cd脅迫響應機制存在基因型差異，損傷類型因品種不同而不同.

研究報道指出Cd脅迫引起大豆DNA損傷，誘導細胞周期阻滯發生在G1/S期［20］，而CyclinB1mRNA水平降低使細胞周期阻滯發生在G2/M期.本研究結果表明，遼豆10號在Cd脅迫下細胞周期阻滯發生在G1/S期，而G1/S期檢驗點在整個細胞周期進程中起著至關重要的作用，因為它是細胞增殖期開始周期，一旦細胞周期事件開始就進入不可逆事件中，無論環境和條件如何改變，細胞都會正常增殖［29］.CAO等［30］采用real-time qRT-PCR分析了細胞周期相關基因的相對表達，與對照組相比，Cd處理組的錯配修復基因MLH1、MSH2和MSH6相對表達量顯著降低.這和擬南芥試驗中基因表達量的結果相似，說明MSH2和MSH6蛋白是Cd誘導DNA損傷的直接傳感器.本研究結果顯示，DNA損傷修復基因MRE11、KU70和RAD51在0.25 mg·L-1Cd時其表達量整體呈上調趨勢，表明MRE11、KU70和RAD51監測到DNA損傷，然后將損傷信號轉導，經過復雜的信號通路對Cd脅迫作出響應，使細胞周期阻滯在G1/S期.徐忠偉等［31］研究顯示，華蟾毒可引起肝癌細胞DNA雙鏈斷裂，感知DNA損傷的蛋白（Mre11，Nbs1和Rad50基因）及負調控因子p53，通過Mre11/Rad50/Nbs1（MRN）復合體將檢測到的DNA損傷情況傳導給效應蛋白分子ATM激酶，對DNA雙鏈斷裂作出應答響應，再將信息傳導給p53蛋白，p53激活，延長半衰期，促進p21CIP1表達，p21CIP1與CyclinA/CDK2/PCNA激酶復合體結合，活性被抑制，細胞周期阻滯在S期［32-33］.

G2/M期和M期轉換點，只是延長或縮短細胞周期事件的時間.本研究結果表明，Cd脅迫下沈農豆20的細胞周期阻滯的時期發生在G2/M期，而遼豆10號是阻滯在G1/S期，由此推測沈農豆20細胞內可能存在跨損傷復制機制，沈農豆20的DNA錯配修復基因MLH1、MSH2和MSH6的表達量均下調，Cd脅迫擬南芥幼苗根尖細胞周期阻滯試驗［30］證實了基因MSH2和MSH6是擬南芥DNA損傷直接傳感器，并且介導G2/M期阻滯，與G2/M期相關的標志性基因CYCB1；1的表達量顯著下調，基因WEE1的表達量呈典型倒U型，與本試驗結果一致.禹黎［34］關于水稻中籽粒Cd積累的QTL定位研究表明，水稻高、低鎘QTL分別與耐鎘QTL和鎘敏感QTL對應，低積累的水稻品種對鎘更加敏感.本研究結果表明，MMR系統的組成部分中MSH2和MSH6蛋白參與了大豆幼苗根尖Cd脅迫誘導的G2期阻滯，可以作為Cd誘導DNA損傷的直接傳感器.同時MSH2和MSH6基因可以作為選育Cd耐性大豆品種的指示標志物.大豆對Cd脅迫響應機制存在基因型差異，這與李沛然等［35］研究大豆對Cd的吸收和轉運存在基因型差異結果相符.通過這種差異可以快速鑒定出大豆品種間的Cd敏感性，且簡單易操作，輔助分子育種，為大豆新品種選育提供理論基礎，為在中、輕度鎘污染的區域從事安全食品生產合理選擇品種提供參考依據，同時，也為后續敏感低積累品種選育及生理、表觀研究等提供可靠的理論基礎.