伊馬替尼與金匱金腎氣丸在人工胃/腸液中的相互作用研究

朱思晗， 常曉慧， 王玲玲， 李欣然， 陳曉霞*

(1.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連 116600；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第967醫院，遼寧大連 116021)

伊馬替尼是一種有效的酪氨酸激酶選擇性口服信號轉導抑制劑[1]，可通過抑制 Bcr -Abl酪氨酸激酶，選擇性抑制 Bcr -Abl 陽性細胞系細胞、急性淋巴細胞白血病患者的新鮮細胞的增殖并誘導其凋亡，用于治療慢性粒細胞白血病(Chronic Myelogenous Leukemia，CML)[2]。該藥物口服吸收好，絕對生物利用度超過97%[3]，使患者生存率得到大大提高。本課題組前期研究發現，長期服用伊馬替尼可引起男性慢?；颊呔訑盗繙p少并出現畸形[4]。

金匱腎氣丸出自《金匱要略》，是漢代醫圣張仲景所創著名方劑，由附子、肉桂、熟地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、茯苓、澤瀉等組成。該方劑配伍嚴謹，療效顯著，被稱為“補腎諸方之祖”，深受歷代醫家推崇，至今仍在臨床上廣泛應用[5]。金匱腎氣丸可通過補腎陽作用，改善小鼠精子畸形率、活動度等[6]。但是中藥成分復雜，與西藥共同服用時，需要充分考慮藥物間相互作用。有研究報道伊馬替尼在體內經多種 CYP450 代謝酶和轉運體作用，在合并用藥過程中易發生藥動學的相互作用[7 - 9]。本實驗以體外模擬胃/腸液為環境，將伊馬替尼與不同濃度金匱腎氣丸共同作用不同時間，通過考察人工胃/腸液中伊馬替尼及金匱腎氣丸中主要化學成分，研究不同濃度金匱腎氣丸與伊馬替尼相互作用，為進一步體內分析及二者的合理用藥奠定理論基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

安捷倫1100高效液相色譜系統(美國，安捷倫)；BSA2224S分析天平(德國，賽多利斯)。

伊馬替尼對照品(純度99.3%，中國藥品生物制藥檢定所)；莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚對照品(純度均≥98.0%，成都曼斯特生物科技有限公司)；胃蛋白酶、胰酶均購自國藥集團北京試劑有限公司；甲磺酸伊馬替尼片(瑞士諾華制藥公司)；乙腈(色譜純，大連銘揚實驗試劑有限公司)；其他試劑均為分析純。娃哈哈純凈水。

金匱腎氣丸(北京同仁堂制藥有限公司)。

1.2 溶液的制備

對照品溶液制備：精密稱取各對照品適量并溶于甲醇，分別配制成含伊馬替尼、莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚質量濃度為2.000 mg/mL的儲備溶液。

空白基質制備：取胰蛋白酶或胃蛋白酶0.1 g，置于50 mL燒杯中，加入10 mL水充分溶解后，加熱煮沸10 min，得到滅活的胰蛋白酶或胃蛋白酶溶液。將以上兩種溶液混合后，加入34 mg KH2PO4，加水定容至25 mL 容量瓶中，即為空白基質溶液。取空白基質溶液1 mL，加入200 μL乙腈渦旋混勻1 min，4 ℃下以20 000 r/min離心10 min。

標準曲線繪制：分別取適量的各對照品儲備液，以空白基質稀釋至含伊馬替尼、莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚濃度分別為200、80、20、30 μg/mL混合標準溶液，依次稀釋為4個梯度混合標品，按“1.3”色譜條件進樣檢測，記錄峰面積。

人工胃液的制備：按文獻方法[10]，取16.4 mL稀HCl，加水800 mL、胃蛋白酶10 g，搖勻使其溶解，用0.1 moL/L HCl調pH至1.3，再加水稀釋并定容至1 000 mL，即得人工胃液。

人工腸液的制備：按文獻方法[10]，取6.8 g KH2PO4，加水500 mL，搖勻使其溶解，用0.1 moL/L NaOH溶液調節pH至6.8；另稱取胰蛋白酶10 g，加適量水溶解；將上述兩種溶液混合后，再加水稀釋并定容至1 000 mL，即得人工腸液。

人工胃/腸液下伊馬替尼樣品配制：取伊馬替尼原藥粉末10.00 mg,加入人工胃/腸液50.00 mL，振蕩混勻，37 ℃水浴孵育，分別在反應0、2、4、8、12 h時取反應液1.0 mL，加入0.2 mL乙腈進行沉淀，然后在5 000 r/min離心10 min，取上清液，用微孔濾膜過濾，取續濾液進行色譜分析。

人工胃/腸液下金匱腎氣丸樣品配制：分別取金匱腎氣丸大蜜丸粉末0.3、0.6、1.2、2.4、3.6 g，加入人工胃/腸液50.00 mL，振蕩混勻，37 ℃水浴孵育，分別在反應0、2、4、8、12 h時取反應液1.0 mL，加入0.2 mL 乙腈進行沉淀，5 000 r/min離心10 min，取上清液用微孔濾膜過濾，取續濾液進行色譜分析。

人工胃/腸液下伊馬替尼+不同濃度金匱腎氣丸樣品配制：取伊馬替尼片、金匱腎氣丸粉末適量，按伊馬替尼片10.00 mg分別添加金匱腎氣丸0.3、0.6、1.2、2.4、3.6 g的比例配制樣品，分別加入人工胃/腸液50.00 mL，振蕩混勻，37 ℃水浴孵育，分別在反應0、2、4、8、12 h時取反應液1.0 mL，加入0.2 mL乙腈進行沉淀，以5 000 r/min離心10 min，取上清液，用微孔濾膜過濾，取續濾液進行色譜分析。

1.3 色譜條件

安捷倫ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)和0.3%H3PO4水溶液(B)。梯度洗脫(0～5 min，95%～92%B；5～20 min，92%B；20～35 min，92%～72%B；35～55 min，72%～40%B；55～60 min，40%B)；流速為1 mL/min；檢測波長240 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2 結果與討論

2.1 方法性能指標考察

2.1.1 線性范圍及定量限考察將標準溶液在優化色譜條件下檢測，以各對照品峰面積為縱坐標(y)，濃度為橫坐標(x)繪制標準曲線。表1列出了各化合物的線性回歸方程、線性范圍、相關系數(R)及定量限。

表1 化合物的線性方程、線性范圍、相關系數(R)及定量限Table 1 Linear equantions,linear ranges, correlation coefficients(R) and limit of quantification(LOQ) of the determined compounds

2.1.2 儀器精密度考察取線性項下含伊馬替尼濃度分別為12.50、50.00、200.00 μg/mL，3個濃度的混合標準溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄1 d內重復測定6次以及連續6 d測定譜圖，各待測化合物的日內及日間精密度(RSD)均<2.0%。

2.1.3 方法準確度考察取伊馬替尼原料藥5 mg及金匱腎氣丸樣品1.8 g，分別加入(低、中、高)三個不同濃度的混合標準溶液，按照“1.2”人工胃液下伊馬替尼+不同濃度金匱腎氣丸樣品配制方法處理后，各取10 μL注入液相色譜儀，計算回收率(表2)。

表2 回收率試驗結果(n=5)Table 2 Results of recovery test(n=5)

2.2 伊馬替尼與金匱腎氣丸在人工胃/腸液中相互作用研究

分別取混合對照品溶液、人工胃液、人工腸液、人工胃/腸液下伊馬替尼樣品、人工胃/腸液下金匱腎氣丸、人工胃/腸液下伊馬替尼+金匱腎氣丸樣品各10 μL，注入高效液相色譜儀進行測定，平行測定3次。由圖1可見，人工胃/腸液對樣品測定不存在干擾，混合標準品在各樣品中分離度好，適用于伊馬替尼與金匱腎氣丸在人工胃/腸液中相互作用研究測定。

圖1 4種標準品及測試樣品的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms obtained for mixed standards and samplesA.Standards(1.Morroniside；2.Loganin；3.imatinib；4.Paenonl)；B.Simulated gastric fluid(SGF)；C.Simulated intestinal fluid(SIF)；D.Imatinib(IM) in SGF；E.Jingui shenqi Pill (JG,3.6 g)in SGF；F.IM+JG(3.6 g)in SGF；G.IM in SIF；H.JG (3.6 g)in SIF；I.IM+JG(3.6 g)in SIF.

由圖2可知，10.00 mg 伊馬替尼中加入不同量的金匱腎氣丸后，人工胃/腸液中伊馬替尼濃度隨著金匱腎氣丸加入量增加，當達到3.6 g時伊馬替尼含量顯著下降，與未加入金匱腎氣丸相比P<0.01；但低濃度金匱腎氣丸對其含量幾乎沒有影響(圖2A)。

在人工胃/腸液中伊馬替尼與不同濃度的金匱腎氣丸共同孵育后，與金匱腎氣丸單獨孵育相比，丹皮酚含量幾乎不受伊馬替尼影響(圖2D)。

不同濃度金匱腎氣丸中馬錢苷含量隨伊馬替尼加入降低，當金匱腎氣丸量高于1.2 g時，馬錢苷含量降低十分顯著(圖2C)。

人工胃液中莫諾苷不受伊馬替尼影響；人工腸液中，金匱腎氣丸量高于2.4 g時，莫諾苷含量降低(圖2B)。

圖2 人工胃/腸液中伊馬替尼與不同濃度金匱腎氣丸相互作用后主要成分濃度變化Fig.2 Concentration changes of main components after interaction between imatinib and Jingui shenqi Pill in SGF/ SIFNotes:A.in SGF，inner is in SIF；**P<0.01 indicates JG+IM showed statistically significant differences from IM with same concentration；#P<0.05 indicates JG+IM showed statistically significant differences from JG with same concentration in SGF；&P<0.05 indicates JG+IM showed statistically significant differences from JG with same concentration in SIF.

伊馬替尼用于治療對干擾素治療失敗的白血病患者，臨床初期使用劑量為600 mg/d，穩定后持續服用推薦最佳使用劑量為400 mg/d?？紤]臨床實際情況，患者急變期以治療為主，不適宜服用金匱腎氣丸，后期維持治療中，可以服用金匱腎氣丸來降低伊馬替尼生殖毒性，提高生活質量。因此本實驗中選擇臨床日推薦服用量分別為400 mg伊馬替尼與12 g金匱腎氣大蜜丸，進行折算為10.00 mg：0.3 g進行研究。

為了更好的探討金匱腎氣丸可能對伊馬替尼穩定性影響，設計了更高劑量組。由實驗可知，當金匱腎氣丸超過12倍以上會對伊馬替尼在胃腸中穩定性造成影響，按照醫囑不會達到該劑量，即使考慮藥物殘留影響，累積濃度也達不到如此高，因此我們推測金匱腎氣丸不會影響胃腸中伊馬替尼消化吸收，能夠保存藥物活性。但伊馬替尼對金匱腎氣丸中苷類化合物溶出有抑制作用，尤其是馬錢苷，藥物之間相互作用關系復雜，有待進一步深入研究。因此，為了避免伊馬替尼體內抑制金匱腎氣丸中主要苷類成分溶出而降低藥效，建議兩者間隔2 h以上服用。

3 結論

本實驗建立了一種穩定性好、精密度及準確度高的測定伊馬替尼與金匱腎氣丸中主要成分含量的測定方法。并用該方法分析了將伊馬替尼及金匱腎氣丸同時孵育于人工胃/腸液后不同時間，伊馬替尼及金匱腎氣丸中主要有效成分含量變化。發現伊馬替尼及金匱腎氣丸同時使用時，主要影響金匱腎氣丸中苷類成分莫諾苷和馬錢苷含量，尤其是含量較低的馬錢苷。因此為了避免伊馬替尼及金匱腎氣丸同時服用降低金匱腎氣丸療效，我們建議金匱腎氣丸謹遵說明書使用，一次一丸，每日兩次服用，與伊馬替尼聯合使用時，間隔2 h以上服用。