基于科研成果的園藝植物病理學綜合性創新實驗教學探索

向妙蓮　徐昭煥　馬建　陳明

【摘要】為增強大學生的創新意識和科研素養，探討綜合性創新實驗教學在園藝植物病理學實驗課程中的應用，設計了“茉莉酸甲酯（MeJA）誘導梨果實抗青霉病的效應與機理”實驗，包括MeJA對青霉病菌（Penicillium italicum）的抑菌活性、誘導梨果實抗青霉病效應及對梨果實病程相關蛋白幾丁質酶（Chitinase，CHI）活性和β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-glucanase，GLU）活性的影響。實踐表明，基于植物病理學基礎理論的綜合性創新實驗有助于學生掌握寄主-病原互作的基本原理和實驗技能，提高學生實驗方案設計、實驗研究組織和實驗結果分析的能力，激發學生的創新精神和科學意識。

【關鍵詞】科研成果? 園藝植物病理學? 綜合實驗? 創新能力

【基金項目】國家自然科學基金（31360466）;江西省高校省級教改立項項目（JXJG-18-3-30）; 江西省高校省級教改立項項目（JXJG-19-3-9）。

【中圖分類號】G640 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-3089（2021）07-0189-02

園藝植物病理學實驗教學是與園藝植物病理學理論課程緊密相關的一個重要教學環節，當前傳統的驗證性實驗教學模式限制了創新性園藝人才的培養。因此，增加綜合性創新實驗課程占比，以適應新農科背景下實驗教學的需要，是目前實驗教學改革創新中值得考慮和重視的問題。高?？蒲谐晒瓤纱龠M生產發展，又可豐富教學資源，有效依托科研優勢提升實驗教學水平，將科研成果轉化為實驗教學的創新模式?？蒲信c教學相互轉化、相互促進，科研反哺教學，科學研究思維方法和實驗操作技能融于一體，具有綜合性、前沿性和應用性的特點，旨在提高學生的探索精神，鍛煉學生的創新思維以及運用理論知識和實驗技能解決具體問題的能力，是目前實驗教學改革研究的熱點[1-4]。

果蔬采后病害是制約園藝產業發展的瓶頸性障礙，目前主要通過化學藥劑控制該病害。為了確保果蔬產品生態、安全，綠色植保防控技術的應用及推廣已迫在眉睫 [5-6]。茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）作為植物抗病反應的重要信號分子作用于植物受體細胞進而參與防御信號的傳導，調控植物免疫系統，增強植物抗病性[7-8]。幾丁質酶（CHI）和β-1，3-葡聚糖酶（GLU）為兩類重要的病程相關蛋白，與果蔬采后抗病密切相關[9-11]。MeJA等外源物質處理可誘導果蔬CHI和GLU活性升高，從而減緩果蔬采后病害的發生[12-13]。

1.綜合性創新實驗特色

園藝植物病理學綜合性創新實驗基于果蔬采后貯藏保鮮領域研究熱點，依托江西省果蔬采后處理關鍵技術及質量安全協同創新中心和江西農業大學農學院等最新研究成果，將茉莉酸甲酯（MeJA）等外源物質誘導果實抗采后病害研究中取得的部分成果轉化為園藝植物病理學實驗的一個教學內容，構建具有綜合植物病理學知識、強化實驗技能訓練和將基礎知識運用于科技前沿研究特點的實驗教學模式[14-15]。綜合性創新實驗通過強調科學問題熱點引領和學生自主設計，學生通過比較MeJA誘導梨果實抗青霉病的效應及對青霉病菌（Penicillium expansum）的抑菌作用差異，逐步將科研成果引入到實驗教學中，激發學生學習專業知識興趣，培養創新思維和創新能力，為學生科研實驗和畢業設計奠定基礎。

2.綜合性創新實驗教學設計

2.1實驗材料

試驗用果：“翠冠”梨果實采自江西省峽江縣金坪鄉果園，于當日采摘后放置于實驗室，挑選無病蟲害、大小統一的果實，放置24h充分散去田間熱后用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡果實1～2min消毒后用自來水沖洗干凈，室溫下晾干后保鮮袋單果套袋，入庫備用（冷庫溫度4～5℃）。

供試菌株：擴展青霉（P.expansum），由江西農業大學植物病理實驗室提供，-80℃保存，試驗前培養5～7d，用無菌水洗脫孢子，經無菌脫脂棉過濾后用血球計數板計數，配置濃度為1.0×106 spores /mL孢子懸浮液，備用。

供試試劑：茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA），購自美國Sigma公司，先使用微量0.1% Tween80和少許乙醇混合均勻，后加無菌水配置為濃度1000 μL/L的MeJA溶液;異羥肟酸（Salicyhydroxamic acid，SHAM，茉莉酸生物合成合成抑制劑），購自美國Sigma公司，先溶于95%乙醇，再用含0.1% Tween 80的無菌水配置成1000 μL/LSHAM備用;CHI活性和GLU活性測定采用試劑盒（Solarbio，北京，中國），乙酸-乙酸鈉緩沖液（含EDTA、β-巰基乙醇）。

2.2 實驗方法

2.2.1 MeJA對P. expansum的抑菌活性

采用牛津杯法測定MeJA對P.expansum的抑制作用。取6 mL供試菌株孢子懸浮液加入54mL溫度約45℃左右PDA培養基中，搖勻，倒入無菌培養皿制成含青霉菌平板。待平板凝固后，在培養皿中心放置無菌牛津杯（直徑為7mm），取100μL濃度為10μmol/L、經0.22μm細菌微孔濾膜過濾的MeJA溶液注入牛津杯中，每個處理重復3次，置25±1℃恒溫培養箱逐日觀察記錄抑菌圈大小。對照組用等量含0.1% Tween80無菌水。

2.2.2 MeJA誘導梨果實抗青霉病效應

將待處理果實置于熏蒸盒（體積6L）內，中央放置滅菌濾紙，將適量 MeJA滴在滅菌濾紙上使盒內MeJA濃度達到10μmol/L，迅速密封塑料盒，對照組用含0.1%Tween80無菌水，另用100μmol/L的SHAM溶液噴施在果實表面，于25℃恒溫培養箱內36h，在果實孔內注入20μL1.0×106 spores/mL青霉孢子懸浮液。每處理10個果，3次重復。以上處理后逐日觀察梨果實發病情況，采用十字交叉法測量病斑直徑，按以下公式計算誘導效果：誘導效果=（對照病斑直徑-處理組病斑直徑）/對照病斑直徑×100%。

2.2.3 MeJ處理對梨果實CHI和GLU活性的影響

試驗設5組處理：CK處理組;10、100和1000 μmol/L MeJA處理組;100 μmol/L SHAM處理組。其他方法同2.2.2，每組處理10個果，每組3次重復。接種后第96 h取病健交界處果肉，液氮迅速冷凍置于-80℃超低溫箱保存，待用。根據曹建康等方法稍微改進，提取CHI和GLU粗酶液，采用試劑盒（Solarbio，北京，中國）測定其活性。

2.2.4 數據分析

試驗數據利用Excel2003和SPSS16.0 統計分析，用單因素方差比較統計各處理平均值的差異，Duncan 氏新復極差法（Duncans new multiple range test）分析各處理間的差異顯著性。

3.綜合性創新實驗結果分析

3.1 MeJA對P. expansum的抑菌活性

培養5 d后MeJA對青霉病菌的抑制作用，與對照相比，濃度為10 μmol/L MeJA的牛津杯周圍無抑菌圈。通過抑菌活性實驗，學生掌握了PDA培養基的配制和牛津杯法測定MeJA對P. expansum的抑菌方法，逐步熟悉園藝植物病理學研究的實驗技能。

3.2 MeJA誘導梨果實抗青霉病的效應

不同濃度MeJA處理對梨果實抗青霉病誘導效應因濃度不同而各異。10和100μmol/L MeJA處理后誘導效應分別為3.45%和14.59%（P <0.05）。

3.3 MeJA處理對梨果實病程相關蛋白活性的影響

10和100 μmol/L濃度MeJA處理組均顯著提高了梨果實CHI活性，分別比對照處理提高了11.02%和45.24%。1000 μmol/L MeJA處理組則抑制了CHI活性，為對照組的85.17%（P <0.05）。100 μmol/L MeJA處理組GLU活性最高，為對照組的1.46倍，而10和100 μmol/L處理之間無顯著性差異（P <0.05）。

4 .綜合性創新實驗教學設計

依托外源物質誘導果實抗病的研究熱點問題，構建MeJA誘導梨果實抗青霉病的綜合性創新實驗課，主要教學設計如下：第一，課前準備——指導教師引導學生逐步熟悉實驗課程的教學目標和主要內容后，每組4～5人查找果實采后誘導抗病相關文獻，以組為單位撰寫可行性實驗計劃，初擬創新性實驗設計和方案，指導教師提出修改意見和建議;第二，課中實施——課時總計8學時，其中2學時準備實驗材料（PDA、病原菌、果實預處理），3學時完成MeJA-病原菌-果實三者互作處理（接種、取樣），3學時（病情統計、GLU和CHI測定，結果分析），各組同學在實驗指導老師協助下不斷完善實驗方案，學習使用儀器設備和統計軟件;第三，課后討論：各組分析討論后小結實驗結果，分析實驗成功和失敗原因，如病原菌污染、接種不發病以及酶活性單位差異等問題，最后指導教師總結分析各組實驗結果，學生結合資料查閱，比較MeJA誘導梨果實抗青霉病的效應和病程相關蛋白活性差異，分析MeJA誘導抗病的可能途徑，撰寫實驗研究報告。

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作者簡介：

向妙蓮（1977年10月-），女，苗族，湖南綏寧人，博士，副教授，研究方向：植物寄主與病原物互作。

陳明（1979年8月-），男，漢族，江西武寧人，博士，副教授，研究方向：果實采后生物學。