白楊素磷脂復合物固體分散體的制備及其體內藥動學研究

龐 榕， 李開言， 王聰穎

(1.黃河科技學院醫學院，河南 鄭州 450005；2.河南省中醫藥研究院，河南 鄭州 450004)

白楊素是蜂膠主要有效成分，也可從紫葳科植物木蝴蝶中提取得到，具有抗菌、抗腫瘤、降血脂、抗糖尿病、預防心腦血管疾病等作用[1-2]，研發價值較高，但由于該成分水溶性和脂溶性較差，口服生物利用度較低，導致臨床應用受到很大限制[3]。崔曉鴿等[3]采用磷脂復合物技術，在一定程度上提高了白楊素體內吸收，但其疏水性較強，從而影響了藥物溶解度和溶出度[4-8]，故需要聯合其他制劑技術以進一步提高其口服吸收生物利用度。

固體分散體是指通過熔融法、溶劑揮發法等制劑技術，將藥物分散于親水載體(如PVP K30等)中的一種固體粉末，有助于增加親水性，改善溶解度，提高溶出速率和溶出度，也可進一步促進藥物口服吸收[9-12]。因此，本實驗采用聚乙烯吡咯烷酮 K30(PVP K30)將白楊素磷脂復合物進一步制成固體分散體，對其存在狀態、溶解度、體外溶出等進行了研究，并考察了其體內藥動學。

1 材料

1.1 儀器 UW220H型電子分析天平(日本島津公司)；U3000型高效液相色譜儀(美國戴安公司)； YSCL-3A型集熱式加熱磁力攪拌器(上海秋佐科技設備有限公司)；TR6120-AT型溶出試驗儀(配置自動取樣儀，深圳市銳拓儀器設備有限公司)；HT-110X50型恒溫振蕩器(上海赫田科學儀器有限公司)；SPR-DT12A-12型智能藥物溶出儀(天津賽普瑞實驗設備有限公司)；D8 ADV型X射線粉末衍射儀(德國Bruker公司)。

1.2 試劑與藥物 白楊素對照品(純度99.1%，批號111701-201501，中國食品藥品檢定研究院)；白楊素原料藥(純度>98.5%，批號171213P，西安一品生物科技有限公司)。大豆磷脂(批號191005，輔必成醫藥科技有限公司)；聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30，批號201548234-3，德國巴斯夫公司)。四氫呋喃為色譜純(德國Merck公司)；正辛醇(批號190915)、無水乙醇(批號191110)(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3 動物 清潔級SD大鼠，雌雄兼用，體質量(280±20)g，購自河南省動物實驗中心，動物生產許可證號SCXK-2016-0001，飼養于相對濕度40%～55%、溫度20～25 ℃環境下。

2 方法與結果

2.1 白楊素含量測定

2.1.1 色譜條件 ZORBAX SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈-0.1%磷酸(55∶45)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長268 nm；進樣量20 μL。

2.1.2 線性關系、方法學考察 精密稱取白楊素對照品20 mg，溶于100 mL乙腈中，作為貯備液(0.2 mg/mL)，精密量取適量，“2.1.1”項下流動相稀釋至10.0、5.0、2.5、1.0、0.5 μg/mL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以白楊素質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得方程為Y=19.481 4X-2.159 1(r=0.999 6)，在0.5～10.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

取10.0、5.0、0.5 μg/mL上述溶液各3份，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得日內精密度RSD分別為0.12%、0.16%、0.24%，日間精密度RSD分別為0.51%、0.47%、0.83%。取約10 mg白楊素磷脂復合物固體分散體至100 mL量瓶中，流動相溶解定容，過濾后取續濾液5 mL至10 mL量瓶中，流動相定容，作為供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得白楊素峰面積RSD為1.06%，表明溶液在24 h內穩定性良好。取白楊素含量已知的磷脂復合物10 mg，分別加入貯備液1、1.5、2.0 mL，同法制備供試品溶液各3份，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得白楊素平均加樣回收率分別為100.14%、99.83%、99.69%，RSD分別為1.06%、0.83%、1.34%。取對照品溶液適量，流動相逐步稀釋，分別以信噪比(S/N)10、3為定量限、檢測限，測得兩者分別為10、5 ng/mL。

2.2 白楊素磷脂復合物及其固體分散體制備 稱取白楊素25.4 mg、磷脂93.6 mg(摩爾比為1∶1.2)，加入四氫呋喃后密封,置于45 ℃水浴中磁力攪拌4 h，減壓旋蒸，即得磷脂復合物，為淺黃色半固體狀的殘留物，置于干燥器中保存。同法制備3批，參考文獻[3]報道測得其復合率均接近100%。

取白楊素磷脂復合物、PVP K30 適量，加入無水乙醇得混懸液，密封，置于45 ℃水浴中磁力攪拌至溶液澄清，減壓旋蒸得殘留物，即得固體分散體，粉碎，過60目篩，保存于干燥器中備用。

2.3 體外釋放研究 取白楊素磷脂復合物及不同載體比例的固體分散體(以白楊素計，含量均為15 mg)，加入3 mL空白溶出介質配制混懸液，轉入透析袋中并扎緊[12](截留分子量為8 000～14 000 Da)，設定儀器溫度、轉速分別為37 ℃、100 r/min，溶出介質為0.5%SDS溶液，體積為900 mL，于0、15、30、60、90、120、240、360、480、720 min各取樣3 mL，補加3 mL空白溶出介質，維持總體積不變，6 000 r/min離心10 min，取上清液進樣分析。

2.4 磷脂復合物與載體比例篩選 圖1顯示，原料藥720 min內累積溶出度僅為20.92%，而磷脂復合物提高至43.51%；磷脂復合物與載體PVP K30比例為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8時，均可提高白楊素溶出速率和溶出度，而且隨著后者用量增加更明顯，綜合考慮溶出速率、溶出度、固體分散體中藥物含量等因素，最終確定兩者比例為1∶6。

圖1 白楊素體外溶出曲線

2.5 X射線粉末衍射(XRPD)分析 取原料藥、物理混合物(白楊素+磷脂+PVP K30)、磷脂復合物、固體分散體適量，置于玻璃內槽中，玻璃片壓制平整后進行XRPD掃描，設定條件為Cu-Kα靶，電壓40 kV，范圍(2θ)3°～45°，速度8°/min，結果見圖2。由此可知，原料藥圖譜中可見特征晶型峰，并且在物理混合物圖譜中仍存在；雖然磷脂XRPD圖譜中也有晶型峰[3]，但本實驗在物理混合物圖譜中未發現，這與PVP K30用量遠大于磷脂用量有關，導致后者XRPD被掩蓋；磷脂復合物圖譜中無白楊素特征晶型峰，表明該成分以無定型狀態存在；在固體分散體圖譜中也未發現白楊素特征晶型峰，表明該成分仍以無定型狀態存在。

注：A～E分別為白楊素、PVP K30+磷脂、物理混合物、白楊素磷脂復合物、白楊素磷脂復合物固體分散體。

2.6 溶解性研究 取過量原料藥、磷脂復合物、固體分散體適量，置于三角瓶中，加入適量正辛醇或蒸餾水，25 ℃水浴中磁力攪拌12 h，取上層混懸液，6 000 r/min離心5 min，取上清液過濾，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，結果見表1。由此可知，將白楊素制成磷脂復合物后，在水、正辛醇中表觀溶解度分別提高至3.21、11.11倍(P<0.01)；將磷脂復合物進一步制成固體分散體后，在正辛醇中表觀溶解度無明顯變化(P>0.05)，而在水中提高了3.53倍(P<0.01)，表明將磷脂復合物制成固體分散體后可大大提高前者水溶性，而且對脂溶性無影響。

表1 白楊素表觀溶解度測定結果

2.7 體內藥動學研究

2.7.1 藥液制備 取原料藥、磷脂復合物、固體分散體適量，0.5%CMC-Na溶液制成含2 mg/mL白楊素的混懸液，即得。

2.7.2 分組、給藥與采血 取大鼠18只，給藥前禁食12 h，隨機分為3組，分別灌胃給予“2.7.1”項下3種藥液，劑量均為20 mg/kg。參考文獻[3]報道及預實驗結果，乙醚麻醉大鼠后于0.167、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、8、12 h迅速眼眶采血0.2～0.3 mL，置于肝素抗凝處理的離心管中，手動振蕩，2 500 r/min離心20 min，取血漿，密封，保存在冰箱冷凍層。

2.7.3 血漿樣品處理 量取正己烷100 mL、二氯甲烷50 mL、異丙醇10 mL，混勻后超聲提取5 min，作為血漿樣品提取液，室溫解凍后取100 μL至離心管中，加入內標溶液(稱取柚皮素對照品10 mg，溶于25 mL乙腈中，即得，質量濃度為400 ng/mL)80 μL、提取液3 mL，于通風櫥中渦旋混合5 min，靜置30 min，轉移有機相至空白離心管中，45 ℃氮氣吹干(注意控制氮氣體積流量)，加入100 μL流動相復溶，8 000 r/min離心5 min后進樣分析。

2.7.4 血漿對照品溶液制備及線性關系考察 取“2.1.2”項下白楊素對照品貯備液，乙腈逐步稀釋至20、50、100、500、1 000、1 500 ng/mL，各取500 μL，45 ℃氮氣吹干后加入500 μL大鼠空白血漿，即得質量濃度為20、50、100、500、1 000、1 500 ng/mL的血漿對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以白楊素、內標(柚皮素)峰面積比值為縱坐標(Y)，白楊素質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得方程為Y=0.168 3X+0.101 2(r=0.993 4)，在20～1 500 ng/mL范圍內線性關系良好。

2.7.5 方法學考察 取20、500、1 500 ng/mL血漿對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下各進樣測定6次，測得日內精密度RSD分別為2.16%、1.95%、2.00%，6 d內日間精密度RSD分別為10.14%、8.43%、5.69%，表明該方法精密度良好。取血漿樣品，按 “2.7.3”項下方法處理，于0、4、8、12、24、48 h在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得白楊素、內標峰面積比值RSD為9.18%，表明樣品穩定性良好。取1只大鼠，按20 mg/kg劑量灌胃給予白楊素混懸液，1.5 h后眼眶采血約3.5 mL，處死，取血漿，分為6份，按“2.7.3”項下方法處理，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得白楊素、內標峰面積比值RSD為10.83%，表明該方法重復性良好。取大鼠空白血漿，配制低(20 ng/mL)、中(500 ng/mL)、高(1 500 ng/mL)質量濃度樣品溶液，按“2.7.3”項下方法處理，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得平均加樣回收率在87.19%～97.46%之間。取20 ng/mL血漿對照品溶液，逐步稀釋后在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得檢測限約為2.0 ng/mL，定量限約為5.0 ng/mL。

2.7.6 結果分析 血藥濃度-時間曲線見圖3，再采用3P97程序統計矩模型計算藥動學參數，結果見表2。由此可知，與原料藥比較，磷脂復合物Cmax、AUC0～t升高(P<0.05，P<0.01)，與文獻[3]報道基本一致；與磷脂復合物比較，固體分散體tmax縮短(P<0.05)，Cmax、AUC0～t升高(P<0.01)。另外，磷脂復合物、固體分散體相對生物利用度分別增加至1.44、2.16倍。

圖3 白楊素血藥濃度-時間曲線(n=6)

表2 白楊素主要藥動學參數

3 討論

磷脂分子中2條長脂肪鏈包裹白楊素分子，同時通過氫鍵、范德華力等作用力結合在一起而形成磷脂復合物[11]，它繼承了磷脂既親水又親脂的特性，從而使白楊素水溶性、脂溶性均有所提高，但前者幅度一般不大，這是因為磷脂是一種疏水性物質，而且磷脂復合物一般以半固體形式存在，分散性差，在一定程度上影響了藥物體外溶出度，不利于其生物利用度的提高[13]。

本實驗結果顯示，固體分散體可提高白楊素磷脂復合物的水溶性及體外溶出度，可能是由于親水性材料PVP K30包裹了磷脂復合物，從而增強了其親水性，而且PVP K30用量是磷脂復合物的6倍，可使后者高度分散于載體材料中，有助于提高其水溶性、溶出速率、溶出度，促進藥物吸收。目前，已有關于白楊素口服納米制劑的報道[14-15]，但其包封率、載藥量均不高，制備工藝復雜；本實驗報道的白楊素磷脂復合物固體分散體制備工藝更為簡單，適合國內中藥制藥公司的實際生產水平。

綜上所述，將白楊素磷脂復合物制成固體分散體后，可解決其水溶性差、溶出速率及累積溶出度低的問題，并能進一步促進藥物吸收[16-17]。但藥物經胃腸道吸收進入血液循環的過程較為復雜，與其水溶性、脂溶性、酶降解作用等因素均有很大關系，而現有制劑技術無法解決藥物所有的吸收瓶頸，導致口服生物利用度的改善情況也會受到影響，今后將作進一步研究。