HPLC法同時測定鹿紅方中7種成分

李素麗， 周 泉， 曹嵐嵐， 林啟焰， 程雪梅， 楊 濤， 周 華*， 王長虹*

(1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院中西醫結合心血管病研究所, 上海 201203；2.上海中醫藥大學中藥研究所，上海市復方中藥重點實驗室，中藥標準化教育部重點實驗室，上海 201203)

鹿紅方又名補腎活血方，由鹿角、紅花、淫羊藿、補骨脂、女貞子、山茱萸、沉香7味藥材組成，方中鹿角咸溫入腎，補腎陽、益精血；紅花辛溫入心，活血通經，兩藥共為君藥；淫羊藿、補骨脂、女貞子、山茱萸共助鹿角平補腎之陰陽，為臣藥；沉香納氣歸腎以助諸補腎藥，使本方補而不滯，是為佐使藥，諸藥合用，共奏補腎活血之功效[1]?，F代藥理研究表明，該方可抑制心肌纖維化[2]，影響血漿RASS產物[3-4]，鹿角中鹿茸多肽[5]、紅花中羥基紅花黃色素A[6]、補骨脂中補骨脂素均對心血管系統具有保護作用[7-9]，淫羊藿中淫羊藿苷[10-11]可增加心臟收縮功能，山茱萸中沒食子酸能顯著降低自發性高血壓大鼠的血壓[12]、莫諾苷和馬錢苷對糖尿病小鼠心肌有一定的保護作用[13]，女貞子中特女貞苷[14]能明顯抑制腎小球系膜細胞凋亡。 本實驗建立HPLC法同時測得鹿紅方中沒食子酸、羥基紅花黃色素A、馬錢苷、沉香四醇、補骨脂苷、異補骨脂苷、特女貞苷的含量，并進行方法學驗證，以期為該方質量標準的制定提供依據。

1 材料

Agilent 1100 series 型高效液相色譜儀(配置Agilent DAD檢測器，美國安捷倫科技公司)；BSA124S-CW電子分析天平(萬分之一)、BT25S電子分析天平(十萬分之一)[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]。羥基紅花黃色素A(批號AF9081601，純度>98%)、馬錢苷(批號AF7110703，純度>98%)、補骨脂苷(批號AF9102107，純度>98%)、異補骨脂苷(批號AF9102108，純度>98%)對照品均購于上海鴻永生物科技有限公司；沉香四醇(批號DST190801-042，純度>98%)、沒食子酸(批號 DST190715-008，純度>98%)對照品均購于成都樂美天醫藥科技有限公司；特女貞苷(批號2018011201，純度>98%)對照品購于成都普利斯生物科技有限公司。鹿角、紅花、補骨脂、淫羊藿、山茱萸、女貞子、沉香飲片均購于上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?，經上海中藥標準化研究中心吳立宏研究員鑒定為正品。乙腈(美國Fisher公司)；甲酸(批號G0960200，上海安譜科學儀器有限公司)；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 ZORBAX SB-Aq色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相乙腈(A)-水(含0.1%磷酸)(B)，梯度洗脫(0～10 min，5%A；10～15 min，5%～10%A；15～35 min；10%～18%A；35～40 min，18%～25%A；40～60 min，25%～35%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長230 nm；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

1.沒食子酸 2.羥基紅花黃色素A 3.馬錢苷 4.沉香四醇 5.補骨脂苷 6.異補骨脂苷 7.特女貞苷

2.2 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸、羥基紅花黃色素A、馬錢苷、沉香四醇、補骨脂苷、異補骨脂苷、特女貞苷對照品適量，甲醇制成質量濃度分別為2.71、8.61、7.61、6.43、17.42、11.88、45.00 μg/mL的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 按處方量稱取藥材約125 g(鹿角15 g、紅花9 g、補骨脂20 g、淫羊藿30 g、山萸肉15 g、女貞子30 g、沉香6 g)，精密稱定，加1 500 mL水煎煮75 min，濾過，濾液減壓濃縮至1 000 mL，作為水煎劑，取適量用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按處方量比例稱取缺紅花、補骨脂、山茱萸、女貞子、沉香的剩余處方藥材約22.5 g(鹿角7.5 g、淫羊藿15 g)，精密稱定，加750 mL水煎煮75 min，按“2.3”項下方法制備，即得。

2.5 線性關系考察 取“2.2”項下對照品溶液適量，稀釋后搖勻，在“2.1”項色譜條件下進樣10 μL測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.6 精密度試驗 取高、中、低質量濃度對照品溶液，同一天內在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次(日間)或連續測定3 d(日內)，測得沒食子酸、羥基紅花黃色素A、馬錢苷、沉香四醇、補骨脂苷、異補骨脂苷、特女貞苷日間精密度RSD分別為1.68%～2.78%、1.10%～2.59%、1.10%～2.93%、1.14%～2.73%、1.35%～2.16%、1.22%～3.24%、0.73%～2.32%，日內精密度RSD分別為1.42%～2.36%、2.38%～6.74%、1.46%～2.77%、1.36%～2.71%、0.84%～1.40%、1.12%～4.01%、0.89%～3.56%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗 取水煎液適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，平行6份，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、羥基紅花黃色素A、馬錢苷、沉香四醇、補骨脂苷、異補骨脂苷、特女貞苷含量RSD分別為2.04%、2.78%、2.51%、2.78%、0.75%、2.49%、0.96%，表明該方法重復性良好。

2.8 穩定性試驗 取水煎液適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，于0、1、4、6、12、16、24 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、羥基紅花黃色素A、馬錢苷、沉香四醇、補骨脂苷、異補骨脂苷、特女貞苷峰面積RSD分別為1.6%、2.7%、2.5%、2.9%、0.9%、1.8%、1.3%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.9 加樣回收率試驗 精密量取各成分含量已知的供試品溶液5 mL，置于10 mL量瓶中，加入50%、100%、150%水平對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，沒食子酸、羥基紅花黃色素A、馬錢苷、沉香四醇、補骨脂苷、異補骨脂苷、特女貞苷平均加樣回收率分別為102.58%、98.85%、100.17%、98.87%、98.61%、97.32%、98.53%，RSD分別為3.72%、3.08%、3.92%、2.02%、1.21%、2.02%、1.14%。

2.10 樣品含量測定 取水煎液適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見表2。

表2 各成分含量測定結果(n=3)

3 討論

2020年版《中國藥典》中，羥基紅花色素A、馬錢苷、沉香四醇、補骨脂素、異補骨脂素、特女貞苷均為鹿紅方中相應藥材的質控指標[15]，雖然補骨脂素、異補骨脂素含量在方中較低，但補骨脂苷、異補骨脂苷在體內可分別轉化為兩者[16]，并且在水煎液中含量較高，故將羥基紅花黃色素A、馬錢苷、沉香四醇、補骨脂苷、異補骨脂苷、特女貞苷作為質控指標；沒食子酸為鹿紅方中山茱萸的指標成分，含量較高，也選擇作為質控指標；淫羊藿苷、莫諾苷雖然可見于鹿紅方水煎液中，但含量較低，不宜作為質控指標，故未將兩者含量進行測定；鹿角中含有大量鹿茸多肽，可介導心肌干細胞分化，修復受損心肌[12]，但本實驗所建立的方法無法對多肽含量進行測定，后期將對其作單獨處理。

本實驗在色譜條件確定過程中，分別以水(含0.1%甲酸)-乙腈、水(含0.1%甲酸)-甲醇為流動相，并對其梯度進行摸索，發現前者洗脫時色譜圖基線平穩，色譜峰峰形對稱，分離度較好。再對檢測波長進行考察，最終確定為230 nm，此時出峰數目多，各成分響應、分離度均理想。