夏蔞止鼾顆粒提取、成型工藝的優化

孫嵐萍， 顧志榮， 馬轉霞， 呂 鑫， 張 銳， 祁 梅， 葛 斌

(1.甘肅中醫藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫院藥劑科，甘肅 蘭州 730000)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)[1]是一種睡眠呼吸紊亂性疾病，主要臨床表現為打鼾，鼾聲不規律，患者自覺憋氣，常伴有夜尿增多、晨起頭痛、頭暈等[2-3]，還可引起高血壓、糖尿病等多種疾病[4]，被稱為夢中的“隱形殺手”，常用治療方法包括藥物、持續氣道正壓通氣(CPAP)、口腔矯治器、外科手術等[5-6]，但療效不佳，臨床應用受限，目前仍無特效藥物。中藥及其復方制劑治療OSAHS時，常采用化痰利濕、寬胸散結通陽、行氣活血導滯等治則，具有療效確切、作用溫和、不良反應小、整體調節等優勢[7]。

夏蔞止鼾方是甘肅省人民醫院張明德主任中醫師擬定的臨床經驗方，目前應用已超過20年，該方由法半夏、瓜蔞、黃芪、茯苓、陳皮等13味中藥組成，具有補氣化痰利濕、寬胸散結通陽、行氣活血導滯等功效，治療氣虛血瘀、痰瘀互結所致OSAHS取得了較好的效果，但原方存在煎煮費時，服藥體積大，服藥時間、劑量、次數難以精確化等缺點，故擬將其制成顆粒劑。本實驗采用正交實驗結合信息熵理論優化夏蔞止鼾顆粒提取工藝，星點設計-效應面法結合G1-熵權法優化該制劑成型工藝，以期為其研發提供技術資料。

1 材料

1.1 儀器 LC-16型高效液相色譜儀[島津儀器(蘇州)有限公司]；UV8100A型紫外-可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)；AL204型電子天平(萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；BSA4202S-CW型電子天平[百萬分之一，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]；SB25-12DTD型超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；HH-6型數顯恒溫水浴鍋(西安超杰儀器有限公司)；DHG-9140A型電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；DD-5M型低速大容量離心機(湘儀離心機儀器有限公司)；YC-1000型實驗室噴霧制粒包衣機(上海雅程儀器設備有限公司)。

1.2 試劑與藥物 法半夏、瓜蔞、連翹、黃芪、陳皮、生地黃、枳實、牛蒡子、澤瀉、薤白、當歸、甘草、水蛭均購于甘肅冠蘭中藥飲片有限公司，經甘肅中醫藥大學中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定為正品，符合2015年版《中國藥典》一部相關規定。連翹酯苷A(批號CHB190123)、橙皮苷(批號CHB180523)、梓醇(批號CHB171010)、芒柄花苷(批號CHB171026)對照品均購于成都克洛瑪生物科技有限公司；預膠化淀粉、麥芽糊精、甘露醇、微晶纖維素、聚維酮均為藥用級輔料。甲醇、甲酸為色譜純(天津大茂化學試劑廠)；其他試劑均為分析純(天津大茂化學試劑廠)；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 提取工藝優化

2.1.1 HPLC法同時測定4種成分含量

2.1.1.1 色譜條件 WondaSil C18-WR色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-水(含0.2%甲酸)(B)，梯度洗脫(0～7 min，8%～13%A；7～10 min，13%～18%A；10～16 min，18%～21%A；16～58 min，21%～55%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

1.連翹酯苷A 2.橙皮苷 3.梓醇 4.芒柄花苷

2.1.1.2 對照品溶液制備 精密稱取連翹酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷對照品適量，甲醇溶解，即得(質量濃度分別為0.90、1.00、1.50、0.27 mg/mL)，避光冷藏備用。

2.1.1.3 供試品溶液制備 精密吸取提取液7 mL，加10 mL甲醇搖勻，超聲提取60 min，放冷，甲醇補足減失的質量，4 000 r/min離心10 min，取上清液，溶劑回收至干，加水溶解，置于25 mL量瓶中，定容，即得。

2.1.1.4 線性關系考察 精密吸取“2.1.1.2”項下對照品溶液0.1、0.2、0.4、1、2、4 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，在“2.1.1.1”項色譜條件下進樣測定。以質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.1.1.5 精密度試驗 取“2.1.1.2”項下對照品溶液，在“2.1.1.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得連翹酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷峰面積RSD分別為1.86%、1.72%、1.47%、1.52%，表明儀器精密度良好。

2.1.1.6 重復性試驗 取提取液6份，按“2.1.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得連翹酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷含量RSD分別為1.67%、1.97%、1.17%、1.39%，表明該方法重復性良好。

2.1.1.7 穩定性試驗 取“2.1.1.3”項下供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得連翹酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷峰面積RSD分別為1.09%、1.93%、1.46%、1.95%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.1.8 加樣回收率試驗 精密吸取“2.1.1.3”項下各成分含量已知的供試品溶液3.5 mL，共6份，精密加入對照品溶液，按“2.1.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，連翹酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷平均加樣回收率為100.09%、101.56%、100.17%、99.43%，RSD分別為1.96%、2.11%、2.03%、1.87%。

2.1.2 單因素試驗

2.1.2.1 加水量 精密稱取處方量藥材約126 g，共5份，浸泡12 h后分別加8、10、12、14、16倍量水，按“2.1.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖2。由此可知，加14倍量水時各成分峰面積開始呈下降趨勢，故選擇12、14、16倍作進一步考察。

2.1.2.2 提取時間 煎煮時間設定為30、60、90、120、150 min，其余同“2.1.2.1”項，結果見圖2。由此可知，隨著提取時間延長，各成分含量升高，但提取60 min后開始呈下降趨勢，故選擇30、60、90 min作進一步考察。

2.1.2.3 提取次數 煎煮次數設定為1～4次，其余同“2.1.2.1”項，結果見圖2。由此可知，增加提取次數時各成分含量呈先升后降的趨勢，故選擇1～3次作進一步考察。

圖2 各因素對提取效果的影響

2.1.2.4 正交試驗 在單因素試驗基礎上，以提取次數(A)、提取時間(B)、加水量(C)為影響因素，連翹酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷含量，干膏率，指紋圖譜相似度為評價指標，采用L9(34)正交試驗優化提取工藝[8]。因素水平見表2。

稱取處方量藥材約126 g，共9份，按表2因素水平提取，按“2.1.1.3”項下方法制備9份供試品溶液，在“2.1.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算各成分含量。精密吸取水煎液10 mL，置于干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，在105 ℃下干燥至恒重，取出，置于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質量，計算干膏率。結果見表3。

表2 提取工藝因素水平

表3 試驗設計及結果(Ⅰ)

2.1.2.5 指紋圖譜建立及相似度評價 吸取“2.1.2.4”項下供試品溶液，在“2.1.1.1”項色譜條件下進樣測定，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012A版)”生成指紋圖譜，中位數法建立對照圖譜(R)，結果見圖3。

圖3 9批樣品HPLC指紋圖譜

2.1.2.6 信息熵理論 建立原始評價指標矩陣X，將其轉換為概率矩陣P，計算權重系數[9]、信息熵(Hi)、i項指標的系數Wi、綜合評分M，Hi=[0.984 0，0.989 7，0.987 0，0.992 2，0.993 0，0.992 8]，Wi=[0.261 0，0.168 0，0.212 1，0.127 2，0.114 2，0.117 5]，M=[(Xi連翹酯苷A/Xmax連翹酯苷A×0.261 0+Xi橙皮苷/Xmax橙皮苷×0.168 0+Xi梓醇/Xmax梓醇×0.212 1+Xi芒柄花苷/Xmax芒柄花苷×0.127 2+Xi干膏率/Xmax干膏率×0.114 2+Xi相似度/Xmax相似度×0.117 5)×100]。結果見表3。

2.1.2.7 方差分析 表4顯示，各因素影響程度依次為A>B>C，即提取次數>提取時間>加水量，其中因素A有顯著影響(P<0.05)，而B、C無顯著影響(P>0.05)。結合單因素試驗和方差分析結果，確定最優工藝為A3B3C2，即加14倍量水煎煮3次，每次1.5 h。

表4 方差分析(Ⅰ)

2.1.2.8 驗證試驗 精密稱取處方量藥材約126 g，共4份，按“2.1.2.7”項下優化工藝進行4批驗證試驗，結果見表5。由此可知，各指標RSD均小于3%，表明該工藝穩定可行。

表5 提取工藝驗證試驗結果(n=4)

2.2 成型工藝優化

2.2.1 顆粒制備 按處方稱取藥材，加入14倍量水煎煮3次，每次1.5 h，濾過，合并濾液，濃縮，噴霧造粒機噴霧干燥后制得干燥恒重浸膏粉，按相應浸膏粉輔料比例混合制成軟材(“握之成團，觸之即散”)，過20目篩，采用擠壓制粒法制粒，60 ℃下烘干，整粒，即得。

2.2.2 指標測定

2.2.2.1 吸濕率 參考文獻[10]報道，精密稱取顆粒2 g，置于干燥恒重敞口的扁形稱量瓶中，輕搖使其分布均勻，放入盛有氯化鈉過飽和溶液的干燥器內，密封48 h后稱定質量，計算吸濕率，公式為吸濕率=[(吸濕后顆粒質量-吸濕前顆粒質量)/吸濕前顆粒質量]×100%。

2.2.2.2 成型率 參考文獻[11]報道，收集通過1號篩而不通過5號篩的合格顆粒，稱定質量，計算成型率，公式為成型率=(合格顆粒質量/顆?？傎|量)×100%。

2.2.2.3 溶化率 參考文獻[12]報道，精密稱取顆粒1 g，置于50 mL恒重離心管中，加入沸水20 mL，攪拌并振搖5 min，4 000 r/min離心10 min，80 ℃下將殘渣烘干至恒重，稱定質量，計算溶化率，公式為溶化率=(溶化的顆粒質量/顆?？傎|量)×100%。

2.2.2.4 休止角 參考文獻[13]報道，采用固定漏斗法，將3只漏斗串聯固定于鐵架臺，最下方漏斗口距離坐標紙1 cm(H)，將顆粒由漏斗壁倒入最高處漏斗口中，待坐標紙上顆粒椎體頂端觸及漏斗下沿時停止，記錄錐體底部直徑為2R，計算休止角α，公式為α=arctan(H/R)。

2.2.2.5 堆密度 參考文獻[14]報道，將顆粒置于恒重量筒中反復振蕩，記錄體積，稱定顆粒質量，計算堆密度，公式為堆密度=顆粒質量/顆粒體積。

2.2.3 輔料篩選 本實驗選擇預膠化淀粉、麥芽糊精、甘露醇、微晶纖維素、聚維酮進行考察，由于浸膏粉黏性較大，故以95%乙醇為潤濕劑，設定浸膏粉與輔料比例為1∶1，潤濕劑用量為浸膏粉與輔料總質量的0.38倍，按“2.2.1”項下方法制備顆粒，測定其吸濕率、成型率、溶化率，結果見表6，最終確定甘露醇、麥芽糊精作為輔料。

表6 不同輔料對成型工藝的影響

2.2.4 星點設計-效應面法 在單因素試驗基礎上，以乙醇用量(A)、浸膏粉與輔料比例(B)、甘露醇與麥芽糊精比例(C)為影響因素，吸濕率(X1)、成型率(X2)、溶化率(X3)、休止角(X4)、堆密度(X5)為評價指標，采用星點設計-效應面法優化成型工藝。因素水平見表7。

表7 成型工藝因素水平

2.2.5 G1-熵權法 根據G1法[15-16]，確定各評價指標影響程度依次為X1>X2=X3>X4>X5，并確定其權重評價標度，其中r2=1.6，r3=1.0，r4=1.2，r5=1.4，計算各指標主觀權重值(w1)，根據熵權法計算各指標客觀權重值(w2)，根據式(1)計算組合權重(w)，結果見表8。再計算綜合評分Y，結果見表9。

表8 評價指標權重值

表9 試驗設計與結果(Ⅱ)

(1)

2.2.6 模型擬合與方差分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件對表9數據進行擬合，得方程為Y=-55.810 17+426.726 61A+111.786 02B+39.079 55C-11.783 75AB+81.911 25AC-29.349 40BC-760.881 43A2-37.247 88B2-15.253 18C2，方差分析見表10。

表10 方差分析(Ⅱ)

2.2.7 響應面分析 通過Design-Expert 8.0.6軟件進行分析，結果見圖4。由此可知，模型最大值點為乙醇用量0.34倍，浸膏粉與輔料比例為1∶0.93，甘露醇與糊精比例1.31∶1，綜合評分為95.094 0分，即為最優工藝。

圖4 各因素響應面圖

2.2.8 驗證試驗 按優化工藝制備5批顆粒，進行驗證試驗，結果見表11。由此可知，平均綜合評分與預測值95.094 0分接近，偏差率僅為-1.12%，表明模型預測性良好，可用于工藝參數的優化。

表11 成型工藝驗證試驗結果(n=5)

2.2.9 臨界相對濕度測定 參考文獻[17]報道，在棕色玻璃干燥器中配置7種鹽過飽和溶液，室溫下放置48 h，使內部濕度平衡，將干燥至恒重的2 g顆粒置于恒重稱量瓶中，均勻攤開，敞口放于相對濕度不同的干燥器中，室溫下放置48 h后精密稱定質量，計算吸濕率，結果見表12。以吸濕率為縱坐標(Y)，相對濕度為橫坐標(X)繪制曲線，在吸濕曲線前后拐點處作切線(分別為Y=0.102 6X-0.644 4、Y=0.783 9X-48.815 5)，兩切線交點對應的橫坐標即為臨界相對濕度，結果見圖5，可知該數值為70.45%。

表12 顆粒吸濕率測定結果

圖5 顆粒吸濕曲線

3 討論

中藥飲片的優劣會直接影響夏蔞止鼾顆粒成型，本研究所用均來自醫院中藥庫，有質量檢驗報告，經驗收人員鑒定為正品后，再經甘肅中醫藥大學中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定，符合2015年版《中國藥典》一部相關規定。中藥復方提取液中活性成分含量對制劑的質量和療效起著至關重要的作用，在煎煮過程中易受到加水量、煎煮時間、煎煮次數等因素影響[18]，本研究選擇多指標成分，再通過客觀賦權法得到綜合評價指標，從而篩選提取工藝。

中藥復方組成藥味繁多，成分復雜，而臨床療效是由方中許多活性成分協同發揮作用的，故評價指標的選擇是其提取工藝研究中十分重要的環節[19]。本實驗選取方中君藥或臣藥的指標成分或有效成分來進行優化，其中連翹酯苷A具有抗氧化、抗炎功效[20]，可改善OSAHA患者呼吸紊亂指數及最低血氧飽和度；橙皮苷具有抗氧化應激、降低脂質過氧化物水平的作用，可抑制氧化應激及炎癥反應；梓醇具有抗腦缺血損傷、抗氧化等作用[21]，能降低MDA水平，抑制炎性細胞因子釋放；芒柄花苷是重要的黃酮類成分，具有抗氧化作用。另外，干浸膏含有大多數上述有效成分或有效部位，能更全面地反映復方物質基礎。因此，本實驗選擇連翹酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷及干膏率作為評價指標。

采用星點設計-效應面法優化夏蔞止鼾顆粒成型工藝時，能較大程度地避免各指標之間優化條件的相互交叉。對綜合評分分別進行多元線性回歸、二項式方程擬合分析，發現后者擬合效果較好，失擬項無顯著差異。驗證試驗結果與模型方程理論值之間的偏差在合理范圍內，表明擬合模型準確可靠，優化工藝穩定可行，重復性較好。但實驗室小試所優化的提取、成型工藝可能存在某些不足，故今后將進行中試，以期為夏蔞止鼾顆粒的工業化大規模生產提供重要依據。