基于數據挖掘和網絡藥理學研究培土生金法治療肺癌的組方規律及分子機制

王小龍

(阜陽市中醫醫院藥劑科，安徽 阜陽 236000)

國家癌癥中心數據顯示，2015年我國新增癌癥患者392.9萬，并有233.8萬人死亡，其中肺癌發病和死亡人數均居惡性腫瘤第1位，它是我國最常見的癌癥，也是導致癌癥死亡的首要原因[1-2]。中醫并無“肺癌”病名，相關論述多散見于歷代關于“肺積”“息賁”“咳嗽”“咯血”“痞癖”“胸痛”“癥瘕積聚”等記載[3]，對肺癌的認識較早，相關治則治法亦有多種，以“母病及子”“脾虛痰聚于肺”為理論的培土生金法在治療肺癌方面具有一定的特色和優勢。本研究借助TCMISS平臺及網絡藥理學相關數據庫，從阜陽市中醫醫院處方切入，篩選治療肺癌的新處方，并分析培土生金法治療肺癌的組方規律及分子機制，闡釋中醫藥治法理論內涵，并為臨床用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 處方來源 2019年度阜陽市中醫醫院中藥房診斷為肺癌、肺惡性腫瘤個人史的門診中藥處方，經篩選后共納入86張，均由阜陽市中醫醫院門診部、國醫堂專家開具，具有一定的代表性。

1.2 數據預處理 由于歷史演變、各地習慣等因素，導致中藥名稱混亂，同藥異名、同名異藥現象普遍存在，給臨床及科研工作帶來諸多不便[4]。為便于統計，降低分析結果的偏差，本研究參考2015版《中國藥典》[5]、高等院?！吨兴帉W》[6]教科書(作為藥物一級和二級功效、性味、歸經分類的文獻依據)《常用中藥別名速查手冊》[7]，對藥名進行規范化處理，其余保證藥名一致即可，中藥拉丁名參考《中藥鑒定學》[8]教材及南京中醫藥大學中藥標本中心(Chinese medicine specimen center of Nanjing University of Chinese Medicine，http://zybb.njucm.edu.cn/)進行規范。

1.3 數據挖掘研究及新處方篩選 將86張處方中的藥物逐一錄入中醫傳承輔助平臺(TCMISS-V2.5，Traditional Chinese medicine inheritance support system)軟件，建立肺癌中藥處方數據庫。進入“數據分析”系統，方劑類別選擇“肺癌”，使用“頻次統計”模塊對藥物使用頻率進行統計，并參照《中藥學》教科書對頻次>2次中藥的功效、性味、歸經進行分類。應用Apriori關聯規則分析模塊，在置信度為0.8條件下，將支持度個數調至26、21、17，分別展示由核心到外圍的藥物關聯規則。采用熵層次聚類分析方法，設置相關度為6，懲罰度為5，基于復雜系統熵聚類以及無監督的熵層次聚類得出用于新方聚類的4條藥物組合，并演化出2首用于治療肺癌的新處方。本研究擬對方二進行進一步的網絡藥理學分析，以探討其治療肺癌的分子機制。

1.4 網絡藥理學分析 進入中藥分子機制在線分析工具(BATMAN-TCM，a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)，選擇Example-2模塊，在Score cutoff為35、AdjustedP-value為0.05條件下，篩選新方活性分子及相應基因。同時以“lung cancer”為檢索詞，在人類基因數據庫(GeneCards，https://www.genecards.org/)尋找支氣管肺癌相關基因。依據基因數量，保留打分≥30的基因進行分析。在Venny-2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)平臺導入新處方相應基因(去重后)及肺癌相關基因，通過取兩者交集，預測新處方治療肺癌的靶基因。同時將預測得到的靶標匹配新方活性分子，建立活性分子-潛在靶基因對應關系，并導入Cytoscape 3.7.0構建網絡圖。使用STRING(https://string-db.org)數據庫構建靶基因PPI蛋白互作網絡，同時應用Cytoscape軟件對核心網絡進行分析。將Degree值>10的16個核心靶標導入Metascape(http://metascape.org/gp/index.html)數據庫進行靶標途徑和通路富集總分析[9]，應用David(https://david.ncifcrf.gov/)數據庫對GO功能及KEGG代謝通路進行進一步的深入分析。

2 結果

2.1 數據挖掘研究 86張處方中共用中藥158味，合計1 479味次。使用頻次≥30次的有12味，前5味分別為半夏、甘草、薏苡仁、白術、砂仁，出現頻次均>40次。使用頻次≥30次的中藥見表1，根據藥物數量，對出現頻次>2次者進行一級、二級功效分類，見表2。在四氣五味方面，以溫性、平性、微寒及甘、辛、苦味較多；在歸經方面，以歸肺、脾、胃經最多，見表3。本研究在置信度0.8條件下，分別設置支持度個數為26、21、17，隨著支持度個數的降低，逐漸出現由核心到外圍的藥物關聯規則。如支持度個數為26時的款冬花-甘草、白術-半夏，支持度個數為21時的款冬花-桂枝、白術-黃芪、紫菀-干姜，支持度個數為17時的款冬花-干姜-桂枝等，見圖1。在Apriori關聯規則分析的基礎上，將相關度設置為6，懲罰度設置為5，聚類出4條用于新方組合的藥組，見表4。通過對4條中藥組合進一步整理，得出2首治療支氣管肺癌的新處方。

表4 新方聚類組合(相關度6，懲罰度5)

圖1 中藥關聯規則(置信度0.8)

表1 使用頻次≥30次的前12味中藥

表2 使用頻次>2次的中藥功效分布

表3 中藥四氣、五味、歸經分布(使用頻次>2次)

2.2 網絡藥理學研究 本研究擬對圖2中的新處方二(白術-干姜-桂枝-款冬花)進行網絡藥理學研究。在BATMAN-TCM平臺搜集新處方活性分子，去除缺乏結構信息和靶標預測項，共整理出新方活性分子66個，包含白術4個，干姜37個，桂枝14個，款冬花11個，見表5；活性分子相應基因分別為白術26條，干姜739條，桂枝208條，款冬花147條，共獲得新處方相應基因1 120條，去重后290條。在Genecards數據庫搜集肺癌相關基因22 399個，其中打分≥30的有614條。將614條肺癌基因與290條新處方基因取交集，獲得交集基因34個，見圖3。將34個交集基因匹配中藥活性分子并導入Cytoscape軟件，得到活性分子-靶基因網絡圖，共90個節點，166條邊，其中內圈為相應基因，外圈散點為活性分子，見圖4。使用STRING、Cytoscape構建靶基因的PPI網絡，共34個節點，174條邊，平均節點度值10.2，局部集聚系數0.616，見圖5。進一步分析其核心網絡節點，篩選Degree值>10的16條核心蛋白節點用于進一步的GO功能及KEGG代謝通路富集分析，見圖6、表6。使用Metascape數據庫對核心靶標進行熱圖富集總分析，基因組中的所有基因都被用于富集背景，依據P<0.01、最小計數為3、富集因子>1.5收集相關項，并根據其相似度進行分組，將前19條具代表性的富集結果予以展示，見圖7。根據DAVID分析結果，核心靶標主要參與的生物過程(BP)共25條，其中P<0.05的有21條；細胞組分(CC)共3條，其中P<0.05的有2條；分子功能(MF)共10條，其中P<0.05的有8條，見圖8。KEGG代謝通路分析顯示34條，其中P<0.05的有27條，見圖9。

圖7 Metascape生物途徑及通路富集總分析

圖8 GO富集分析

圖9 KEGG通路富集分析

表6 新處方二中核心靶標(度值>10)

圖2 治療肺癌新處方(相關度6，懲罰度5)

圖3 肺癌靶基因韋恩圖

圖4 活性分子-靶基因網絡圖

圖5 蛋白相互作用網絡

圖6 PPI核心網絡節點

表5 新處方二中4味藥材活性分子

3 討論

中醫歷來重視痰飲與腫瘤間的關系，因腫瘤是全身疾病的局部表現，肺癌的發生亦與痰飲相關。津液代謝障礙，痰氣郁結阻滯中焦氣機，久則痰飲內停，聚結于肺，發為腫瘤[10]，故痰飲可能是肺癌發生發展的關鍵環節。治法方面，當以甘、溫之藥為主。以甘溫除痰飲，蓋因肺為貯痰之器，然脾乃生痰之源。古有仲景之黃芪建中湯治肺虛損不足，創甘溫培土法；又有東垣謂脾胃一虛，肺氣先絕，創甘溫健脾之法[11]。

培土生金是古代五行學說在中醫治法方面的具體應用，根據“虛則補其母”“其標在肺……其制在脾”等理論，從脾胃入手，通過健脾胃使得肺氣充實，土旺則金自生[12]。中醫培土生金法在祛邪的同時更加注重扶正的作用，從病因的角度看待疾病的發展，扶助正氣，激發患者自愈潛能，不失為治療肺癌的重要思路[13]。中西并舉，遵循“認病辨證”的原則，充分發揮現代醫學精準定性、定位，局部腫瘤控制率高的優勢，結合中醫培土生金的診療特色，可極大改善患者的臨床獲益[14]。尤其在緩解臨床癥狀[15]、防治復發轉移[16]、治療癌因性疲乏[17]、以及對化療藥的減毒增效[18]等方面均體現其獨到的優勢，值得進一步深入研究。

在宏觀層面，本研究從86張肺癌處方中過濾出半夏、甘草、薏苡仁、白術、砂仁等高頻藥物。以化痰止咳平喘、補虛、清熱、利水滲濕、化濕等藥物為主，包含了補氣、清熱解毒、止咳平喘、清化熱痰、利水消腫、溫化寒痰、補陰等二級功效。通過進一步分析，發現本院治療肺癌的中藥性味以甘溫為多，主入肺、脾、胃經。進一步應用Apriori關聯規則分析，從核心到外圍全面展示了本院治療支氣管肺癌的用藥規律。通過熵層次聚類分析，得出“大棗-魚腥草-山慈菇”“款冬花-桂枝-干姜”“黨參-白花蛇舌草-重樓-半枝蓮”“款冬花-白術-干姜”四條核心藥組。經進一步整合，篩選出2首治療肺癌的新處方，皆有脾肺同治之意。尤其新處方二，桂枝-白術能化氣健脾，干姜-白術善溫中化飲，伍以款冬花溫肺化痰，四藥合用，發揮健脾溫肺、培土生金的功效。本研究對處方“白術-干姜-桂枝-款冬花”進行進一步的網絡藥理學分析，闡釋該方培土生金治療肺癌的分子機制。

從“宏觀到微觀”角度看，脾胃為氣機之樞、居中央以灌四旁，脾胃在人體的特殊地位決定了其對生命調控的特殊作用[19]。腫瘤的發生發展一直伴隨著分子、細胞與宿主-腫瘤微環境的相互修飾，中醫藥改善調節宿主-腫瘤微環境的作用，可能是其抗腫瘤的最終作用機制[20]。本研究結果顯示，新處方“白術-干姜-桂枝-款冬花”治療肺癌具有多靶點-多通路-整合調節的特點，其培土生金的實質內涵可能主要通過影響能量代謝而發揮“補脾”“培土”的功效，通過作用于細胞因子及炎癥介質等發揮“溫肺”“生金”的作用。一方面，脾胃居中焦，主運化，為“后天之本”“氣血生化之源”“氣機升降之樞”，脾胃的這些功能特點決定了其與細胞能量代謝的密切關系[21-23]。腫瘤細胞不但可以盡可能多地吸收和利用周圍的營養物質，而且可以根據微環境的改變選擇更有利的代謝方式[24]?；罨腁MPK可以增強分解代謝，抑制合成代謝，應對細胞內外環境的刺激，并且影響細胞的生長、增殖、凋亡、自噬等基本生物學過程，廣泛影響腫瘤的發生、生長，發揮重要的腫瘤拮抗作用[25]。另一方面，細胞因子在腫瘤細胞的發生及發展過程中扮演重要角色[26]。首先，有研究[27]提示血清 TNF-α、IL-1β等炎性細胞因子可能參與了NSCLC的發生、發展，且與NSCLC的病理進程和預后密切相關。IFNG基因編碼的干擾素-γ(IFN-γ) 在病毒和細菌感染的免疫應答中發揮重要作用，IFNG基因rs2069705位點可能與肺癌風險具有相關性[28]。HIF-1α的高表達與NSCLC臨床分期及淋巴結轉移密切相關，而CXCR4作為HIF-1α的下游因子之一，兩者通過相互調控促進腫瘤細胞的增殖與轉移[29]。其次，INS的高低或與肺癌的發展有關。盡管糖尿病和肺癌之間存在諸多混雜因素，其對肺癌影響的詳盡機制仍需大量研究深入證實[30]。但胰島素抵抗和高胰島素血癥的代償可通過INS及IGF-1受體的激活而發揮促進腫瘤生長的作用[31]。IGF-1在胰島素受體介導的信號轉導中起重要作用[32]。其可能通過自分泌和旁分泌等方式作用于肺癌細胞，并通過AKT信號通路促進人肺癌A549細胞增殖、侵襲與轉移[33-34]。此外，MMP9[35]、SERPINE1(PAI-1)[36]表達的上調亦與肺癌的侵襲和轉移密切相關。

綜上所述，本研究從阜陽市中醫醫院86張肺癌處方中篩選出以“白術-干姜-桂枝-款冬花”組成的新處方，新處方甘溫護中、健脾溫肺，體現了培土生金的治則治法。這一治法的實質內涵可能與調節細胞的增殖、分化、凋亡、免疫應答以及炎癥反應有關。其可能主要通過影響能量代謝、細胞因子及炎癥介質等而作用于肺癌的發生、發展與轉移等環節，從而發揮培土生金的作用。