基于網絡藥理學技術研究桂枝顆粒治療鼻炎的作用機制

孫元芳， 劉輝見， 肖 雪， 張怡萍， 李莎莎， 嚴詩楷1,

(1.上海交通大學藥學院，上海 200240；2.廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東 廣州 510006；3.山西太行藥業股份有限公司，山西 長治 046000；4.廣東藥科大學中醫藥研究院，廣東 廣州 510006)

鼻炎是病毒、細菌、變應原、各種理化因子以及某些全身性疾病引起的鼻腔黏膜炎癥，其臨床表現為鼻塞、多涕、嗅覺下降以及頭昏、頭痛等[1-2]。中醫理論認為，鼻炎多由肺氣虛寒，衛表不固，則腠理疏松，風寒之邪或異氣易于乘虛而入。臨床常用桂枝湯加減方解肌發表，調和營衛。

桂枝湯由桂枝、芍藥、生姜、大棗、甘草配伍而成。此方性溫味辛，既能溫肺，又能驅邪以通竅，同時調和營衛以達到改善體質的作用?，F代臨床研究表明桂枝湯通過減少鼻分泌物，保護鼻黏膜組織，減少血清中組胺、免疫球蛋白E(IgE)的表達[3]，抑制T輔助細胞2(Th2)的分泌功能，減少白介素4(IL-4)的釋放[4]，抑制嗜酸性粒細胞的聚集、活化[5]，緩解鼻炎癥狀。桂枝顆粒作為桂枝湯的現代制劑，也具有治療鼻炎的作用，但其治療鼻炎作用機制尚未見報道。

本研究擬從網絡藥理學的角度出發，預測桂枝顆粒治療鼻炎的藥效成分和潛在靶點，并通過基因本體(GO)功能分析和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路分析得到與桂枝顆粒治療鼻炎相關的信號通路和代謝途徑。本研究結果為揭示桂枝顆粒治療鼻炎的作用機制提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 桂枝顆粒藥效成分與靶點的收集 在中藥系統藥理數據庫及分析平臺(TCMSP)數據庫(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)中搜索白芍、甘草、桂枝、生姜、大棗中文名，得到的化學成分經過去重合并，即為桂枝顆粒成分，篩選出同時滿足生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18者，即為潛在藥效成分。根據TCMSP數據庫中藥效成分的“Related Targets”收集藥效成分相關靶點，采用Cytoscape3.7.0軟件對成分與靶點的關系進行可視化處理。

1.2 鼻炎相關靶點的獲取及蛋白互作網絡的構建 利用GeneCards數據庫(http://www.genecards.org/)搜索鼻炎英文名“rhinitis”，得到與鼻炎相關的基因。將疾病靶點輸入STRING數據庫(https://string-db.org/)，進行蛋白互作分析，并導出為.tsv文件。將文件中node1、node2信息導入Cytoscape3.7.0軟件，繪制蛋白互作網絡。

1.3 桂枝顆粒治療鼻炎的關鍵藥效成分和潛在靶點獲取 對桂枝顆粒藥效成分靶點與鼻炎相關靶點進行匹配分析，篩選出桂枝顆粒治療鼻炎潛在靶點，并根據潛在靶點與藥效成分的關系篩選出桂枝顆粒的關鍵藥效成分，整理它們與潛在靶點之間的關系，利用Cytoscape3.7.0軟件，構建桂枝顆粒-關鍵藥效成分-靶點-疾病網絡。

1.4 生物信息學分析 通過Cytoscape3.7.0軟件中的ClueGO插件，對桂枝顆粒治療鼻炎潛在靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，構建靶點-通絡網絡。再導出結果，篩選合適的通路，與桂枝顆粒-關鍵藥效成分-靶點-疾病網絡合并，建立桂枝顆粒-關鍵藥效成分-靶點-通路-疾病網絡。

2 結果

2.1 桂枝顆粒藥效成分與靶點的收集 桂枝顆粒藥效成分共有113種。從TCMSP數據庫中得到其相關靶點267個，采用Cytoscape3.7.0軟件構建藥效成分-靶點網絡。圖1顯示，該網絡中共有380個節點，2 084條邊，網絡中心度為0.379，平均鄰居節點數為10.968，說明網絡各節點間相關性較高。

注：代表藥效成分，代表靶點。

2.2 鼻炎相關靶點的獲取及蛋白互作網絡的構建 GeneCards數據庫中輸入rhinitis檢索鼻炎相關靶點，得到1 415個基因。將靶點輸入STRING數據庫得到蛋白互作網絡，利用Cytoscap3.7.0軟件對疾病靶點互作網絡可視化，得到疾病靶點互作圖，見圖2。由此可知，該網絡共有412個節點，7 502條邊，網絡中心度為0.393，平均鄰居節點數為36.417。

注：代表靶點。

2.3 桂枝顆粒治療鼻炎的關鍵藥效成分和潛在靶點獲取 桂枝顆粒治療鼻炎的潛在靶點共22個，分別為雄激素受體(AR)、花生四烯酸5-脂氧合酶(ALOX5)、芳香烴受體(AHR)、過氧化氫酶(CAT)、CD40配體(CD40LG)、C-反應蛋白(CRP)、雙氧化酶2(DUOX2)、表皮生長因子受體(EGFR)、谷胱甘肽S-轉移酶MU 1(GSTM1)、血紅素加氧酶1(HMOX-1)、細胞間黏附分子1(ICAM1)、γ干擾素(IFNγ)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、MAPK14、MAPK3、MAPK8、髓過氧化物酶(MPO)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、孕酮受體(PGR)、信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)、腫瘤壞死因子(TNF)、血管內皮生長因子A(VEGFA)，具體信息見表1。根據潛在靶點與藥效成分的關系，篩選出桂枝顆粒的關鍵藥效成分82種，包括黃酮類、萜類、香豆素、生物堿、植物甾醇，見表2。整理關鍵藥效成分與關鍵靶點之間的關系，構建關鍵藥效成分-靶點網絡，見圖3。

表1 桂枝顆粒治療鼻炎的潛在靶點

表2 桂枝顆粒治療鼻炎潛在關鍵有效成分信息表

注：代表藥效成分，代表靶點。

2.4 生物信息學分析 利用Cytoscape3.7.0軟件中ClueGO插件對22個桂枝顆粒治療鼻炎潛在靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，結果見圖4(Group00代表peptidyl-tyrosine autophosphorylation，Group01代表regulation of morphogenesis of a branching structure，Group02代表regulation of protein deacetylation，Group03代表nuclear receptor activity，Group04代表hydrogen peroxide metabolic process，Group05代表positive regulation of protein localization to cell periphery，Group06代表positive regulation of protein localization to plasma membrane，Group07代表negative regulation of lipid storage，Group08代表positive regulation of reactive oxygen species metabolic process，Group09代表reactive oxygen species biosynthetic process，Group10代表astrocyte differentiation)。在GO功能富集分析過程中，共確定了93條生物過程GO條目，主要涉及脂質貯存、核受體活性、蛋白定位、細胞分化、氧化應激等方面；通過KEGG通路富集分析，篩選P<0.05且至少匹配3個靶點基因的通路，共得到9條信號通路與桂枝顆粒治療鼻炎相關，其中TNF信號通路、叉頭轉錄因子(FoxO)信號通路、高親和力IgE受體(Fc epsilon RI)信號通路、T細胞受體信號通路、IL-17信號通路、MAPK信號通路、Th17分化、松弛素(Relaxin)信號通路、缺氧誘導因子1(HIF-1)信號通路與桂枝顆粒治療鼻炎的潛在作用機制相關，見圖5。將桂枝顆粒82種關鍵藥效成分、22個潛在作用靶點、9條信號通路關聯建立桂枝顆粒-關鍵藥效成分-潛在作用靶點-信號通路-鼻炎網絡，見圖6。

續表2

圖4 22個潛在靶點的GO功能富集分析

圖5 22個潛在靶點的KEGG通路分析

注：代表藥效成分，代表靶點，代表通路，代表鼻炎。

3 討論

3.1 桂枝顆粒治療鼻炎的潛在藥效成分 黃酮類、萜類、香豆素、生物堿、植物甾醇5大類成分可能是桂枝顆粒治療鼻炎的物質基礎。黃酮類成分包括槲皮素、山柰酚、甘草查爾酮A等。槲皮素對卵清蛋白誘導的過敏性鼻炎有緩解效果[6]；槲皮素和山柰酚治療過敏性鼻炎的作用機制與HMOX-1[7-8]和抑制IgE介導的TNF-α和IL-6的產生相關[9]；甘草查爾酮A能抑制單核細胞和T細胞免疫相關細胞因子的產生，具有免疫調節作用[10]。這些研究報道與本研究結果一致，提示黃酮類成分是桂枝顆粒治療鼻炎的物質基礎。

萜類成分包括芍藥苷、蒼耳酮、樺木酸和β-胡蘿卜素，生物堿包括小檗堿和荷葉堿，植物甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇和川貝海綿甾醇。目前雖尚無文獻報道這些成分與鼻炎之間的直接聯系。但這4類化合物都具有調節免疫，抑制炎癥反應的作用[11-14]。結合本研究結果可推測桂枝顆粒中的黃酮類、萜類、香豆素、生物堿、植物甾醇等成分可能是其發揮治療鼻炎療效的物質基礎。

3.2 桂枝顆粒治療鼻炎的關鍵通路 桂枝顆粒通過多成分-多靶點-多通路發揮治療鼻炎的藥效。KEGG通路富集分析發現，桂枝顆粒治療鼻炎的作用機制涉及TNF、FoxO、Fc epsilon RI、T細胞受體、IL-17、MAPK、Th17、Relaxin和HIF-1等信號通路。

TNF信號通路可觸發NF-κB和MAPK途徑。TNF是一種可以直接殺傷腫瘤細胞，對正常細胞沒有明顯細胞毒性的細胞因子。其參與全身炎癥反應，是組成急性期反應的細胞因子之一。王忠喜[15]研究表明在變應性鼻炎的發病中TNF-α和IL-8發揮了重要的作用。Fc epsilon RI復合物是由抗原特異性IgE的Fc端與細胞表面高親和力受體相互作用而形成，過敏性鼻炎中Fc epsilon RI復合物水平增加，可進一步誘導B細胞中的IgE合成，加重鼻炎[16]。桂枝顆?？赡芡ㄟ^降低Fc epsilon RI復合物水平達到緩解鼻炎的作用。T細胞表面的T細胞受體可特異性識別抗原提呈細胞表面主要組織相容性復合體提呈的抗原肽，并激活T細胞內部細胞外調節蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶、NF-κB等信號通路，從而調控T細胞的增殖、分化、死亡。Th17細胞是由Th0細胞在IL-6和轉化生長因子β的刺激下分化而成的，在免疫調節、宿主防御和自身免疫性疾病中發揮關鍵作用。石小偉等[17]研究表明間歇性變應性鼻炎患者外周血中Th17細胞占外周血中CD4+T淋巴細胞的比例在間歇期降低，發作期前、發作期升高，表明Th17細胞表達與過敏性鼻炎發病有關。Cheng等[18]研究表明過敏組中產生IL-17α的調節性T細胞增加，同時過敏組中調節性T細胞抑制效應Th17產生的能力顯著降低。IL-17在宿主免疫學中起關鍵作用，其可以保護宿主抵抗細胞外病原體，但也可以激活MAPK、NF-κB等途徑中的抗細胞因子和趨化因子，促進自身免疫性疾病的炎癥病理。 Lv等[19]觀察到百里香可降低IL-17基因表達，減輕過敏性鼻炎癥狀。MAPK信號通路是真核細胞介導細胞外信號到細胞內反應的重要信號轉導系統，調節細胞的生長、分化、凋亡和死亡等多種生理過程。Liu等[20]研究認為p38 MAPK信號通路調控Th2細胞因子釋放，導致過敏性鼻炎的發病。既往研究[21]顯示HIF-1α可緩解過敏性鼻炎模型小鼠的鼻炎癥狀。

4 結論

本研究基于網絡藥理學技術，揭示了桂枝顆粒中黃酮類等成分調控免疫相關通路治療鼻炎的作用機制，可為闡明該制劑治療鼻炎的作用機制提供了研究基礎，但這些成分與靶點、靶點與靶點之間的相互關系還需要進一步的實驗來驗證。