拮抗miR-21對人工合成高效孕激素作用下子宮內膜癌細胞增殖和凋亡的影響

田春花,張 嬌,楊梅芳,楊威龍,吳 陽,金 秋,馬鴻云

子宮內膜癌(EC)是女性生殖系統惡性腫瘤之一，發病率位于女性惡性腫瘤首位，近年來發病率、死亡率呈逐年遞增且年輕化趨勢[1]，其中有14%左右子宮內膜癌患者是育齡女性[2]，這部分人群中約70%仍未生育[3]。以孕激素為基礎的保守治療為這些年輕患者保留生育能力提供了臨床選擇[4]。然而，孕激素治療的完全緩解率(CR)僅70%左右，仍有約30%的患者對孕激素治療不敏感[5],這給有生育要求的早期子宮內膜癌患者的治療帶來困難，究其原因可能與PR 表達水平下降、功能異常以及相關基因突變、信號通路異常等有關[6]。孕激素抵抗機制的靶向治療可能逆轉孕激素抵抗，孕激素聯合靶向治療可能成為早期且有生育要求子宮內膜癌保守治療的新手段。有研究發現，子宮內膜癌患者中存在多種 mi-RNA的異常表達，這說明 mi-RNA 參與子宮內膜癌的發生、發展[7-8],同時Lai 等[9]的研究發現miR-21具有促進子宮內膜癌發生的作用。本實驗在人工合成高效孕激素作用下，研究拮抗miR-21對子宮內膜癌 Ishikawa 細胞的增殖與凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料:人子宮內膜癌細胞系 Ishikawa(BNCC338359，北納生物)。

1.2 主要實驗試劑與儀器:完全DMEM培養基(KGM12800S-500，凱基生物)；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent(L3000015，invitrogenTM)；miR-21拮抗劑(中洪博元分子實驗室提供)；人工合成高效孕激素(左炔諾孕：LNG)(S1727)；倒置熒光顯微鏡(MF53，廣州市明美光電有限公司)；多功能酶標分析儀(SAFIREII，TECAN)；離心機(TD4A，長沙英泰儀器有限公司)；紫外可見分光光度計(UV-1600PC，上海美譜達儀器有限公司)；超高靈敏度化學發光成像系統(Chemi DocTM XRS+，伯樂生命醫學產品(上海)有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 CCK8檢測:將人子宮內膜癌細胞消化、重懸、計數、鋪96孔板(細胞密度為5×103個/孔)，待子宮內膜癌細胞貼壁后，按照分組進行相應處理，處理24 h向待測板中每孔加入10 μl CCK-8(KGA317，凱基生物)反應2 h，分別采用酶標儀(SAFIREII TECAN)在波長450 nm處檢吸光值并計算細胞的存活率。

1.3.2 細胞劃線:待子宮內膜癌細胞鋪板密度達到90%以上后進行細胞劃線，使用200 μl槍頭(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)在每孔進行劃痕，棄去培養基，用PBS(KGB5001凱基生物)清洗3次，換成無血清培養基后給每孔劃痕拍照；將細胞放入培養箱中，24 h后再次給每孔的劃痕拍照；48 h后再次給每孔的劃痕拍照。測量細胞劃痕寬度，進而計算出細胞的遷移速率。

1.3.3 細胞侵襲:將子宮內膜癌細胞消化收集后離心，用無血清培養基重懸細胞并且計數，使每個小室細胞數為3×104個；在小室加入500 μl完全培養基，上室細胞與無血清培養基總體積約300 μl；48 h后進行結晶紫(G1061，Solarbio)染色。去除各孔中的培養基，然后加入PBS(KGB5001 凱基生物)清洗5 min,加配好的0.1%結晶紫染色1 h,染完后擦去小室的內室細胞，之后將小室倒置拍照,拍照完成后去除孔中的染色液，在每個孔中加入配制好的33%乙酸(取33 mL 100%乙酸加到67 mL純水中混勻)2 mL溶解細胞中的染液，充分混勻靜置后，用分光光度計(波長為570 nm)，用33%乙酸調零，測定每孔中的溶液的吸光值，平行三次。

1.3.4 流式檢測凋亡:在使用流式細胞前,首先對樣品進行預處理。棄子宮內膜癌細胞株上清液，每孔1 mL PBS(KGB5001 凱基生物)潤洗2邊，加200 μl含EDTA胰蛋白酶消化液(T1300 Solarbio)，放入37℃培養箱(型號：BPN-80CM，上海一恒科學儀器有限公司)，當子宮內膜癌細胞消化后，用含血清的完全培養基終止子宮內膜細胞消化、吹散后收集子宮內膜癌細胞懸液。將子宮內膜癌細胞懸液在2 500 r/min離心(常州中捷實驗儀器制造有限公司，型號：TGL-16D)3 min并棄上清液。加1 mL PBS(KGB5001 凱基生物)后再2 500 r/min離心3 min后棄去子宮內膜癌細胞上清液，每管加PBS 300 μl混勻后再加入 5 μl Annexin V-FITC(AP101-100-kit，MULTI SCIENCES 聯科生物) 和 5 μl PI，輕混勻后，待室溫避光孵育10 min后上機。

1.4 實驗分組:空白細胞組為未經任何處理的 子宮內膜癌Ishikawa 細胞；高效孕激素組為經人工合成高效孕激素處理的子宮內膜癌Ishikawa 細胞；高效孕激素+miR-21組為經人工合成高效孕激素聯合miR-21拮抗劑處理的子宮內膜 Ishikawa 細胞。

2 結果

2.1 各組干預前、后Ishikawa細胞增殖情況的變化： 干預前與干預24 h后高效孕激素組細胞增殖率、高效孕激素+miR-21組細胞增殖率比較差異有統計學意義(P<0.05)；干預后，高效孕激素+miR-21組細胞增殖率最低(P<0.05)，見表1。

表1 各組干預前、后細胞增殖情況的比較

2.2 各組干預前、后Ishikawa細胞遷移情況的變化：干預前與干預24 h后高效孕激素組細胞遷移率、高效孕激素+miR-21組細胞遷移率比較差異有統計學意義(P<0.05)。干預后，高效孕激素+miR-21組細胞遷移率最低(P<0.05)，見表2。

表2 各組干預前、后細胞遷移情況的比較

2.3 各組干預前、后Ishikawa細胞侵襲情況的變化：干預前與干預24h高效孕激素組細胞侵襲力、高效孕激素+miR-21組細胞侵襲力比較差異有統計學意義(P<0.05)；高效孕激素+miR-21組細胞侵襲力最低(P<0.05)，見表3。

表3 各組干預前、后細胞侵襲情況的比較

2.4 各組干預前、后Ishikawa細胞凋亡情況的變化：干預前與干預24 h后高效孕激素組細胞凋亡率、高效孕激素+miR-21組細胞凋亡率比較差異有統計學意義(P<0.05)；干預后高效孕激素+miR-21組細胞凋亡率最高(P<0.05)，見表4

表4 各組干預前、后細胞凋亡情況的比較

3 討論

單獨應用孕激素或聯合宮腔鏡病灶切除是年輕早期子宮內膜癌患者最常用、最有效保留生育能力的治療方式[1,10-12]。本次實驗結果顯示，子宮內膜癌Ishikawa 細胞經人工合成高效孕激素處理24 h后，其增殖率、遷移力及侵襲力降低(P<0.05)，凋亡率增高(P<0.05)，進一步證實人工合成高效孕激素對子宮內膜癌Ishikawa 細胞的抑制作用，為人工合成高效孕激素用于早期子宮內膜癌患者保留生育功能治療提供了理論依據。

雖然孕激素治療早期子宮內膜癌的效果已得到肯定，但仍有約30%的患者對孕激素治療不敏感或無反應，這給年輕患者保留生育功能治療帶來巨大困難。針對孕激素抵抗機制的靶向治療可能逆轉孕激素抵抗，應用孕激素聯合靶向治療可能成為有生育要求的子宮內膜癌患者治療的新手段。

微小RNA(miRNA)屬于內源性非編碼小分子RNA，它以互補配對的方式與靶基因的3′UTR區結合，降解靶基因mRNA或抑制靶基因mRNA的翻譯，并在轉錄后負責調控靶基因的表達，從而影響腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和轉移[13]。有研究發現子宮內膜癌細胞中存在多種微小RNA表達異常，這預示著miRNA參與子宮內膜癌的發生、發展[7-8]。近年來的研究表明，miRNA與子宮內膜癌的發生、發展過程密切相關，參與調節子宮內膜癌發生、發展的分子機制和孕激素受體的表達[14]。miR-21在多種腫瘤中高表達[15]，大量研究證實，多發性腫瘤抑制基因mRNA的3′非編碼區含有miR-21特異性識別和結合位點[16]。在子宮內膜癌患者血清、癌組織中均見miR-21高表達，且其表達的程度與淋巴轉移、不良預后密切相關[9]，這提示miR-21可能參與了子宮內膜癌的發生、發展。秦曉燕[17]等的研究證實了上述觀點。這為臨床子宮內膜癌的基因治療提供了依據。本研究顯示,在人工合成高效孕激素作用下，聯合使用miR-21 拮抗劑，子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖率、遷移和侵襲能力較聯合處理前降低(P<0.05)，而細胞凋亡率較聯合處理前升高(P<0.05)。這說明聯合使用人工合成高效孕激素和miR-21拮抗劑可以抑制子宮內膜癌細增殖，促進凋亡。此外，本研究還表明，與空白組及高效孕激素相比，高效孕激素+miR-21組的Ishikawa 細胞增殖率、遷移力及侵襲力最低，而凋亡率最高，組間比較差異具有統計學意義(P<0.05)。這說明在使用人工合成高效孕激素的作用下，拮抗miR-21可以增加抑制子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖及促進其凋亡的作用，提示人工合成高效孕激素與miR-21拮抗劑可能存在協同抗癌效應。