miR-223靶向下調IGF1R基因表達對抑制卵巢顆粒細胞增殖及促進凋亡的影響

柏 玲,陳 晨

工作壓力的增大、環境有害物質的增加等多種因素作用，使女性卵巢功能損傷、生育能力下降的問題逐漸顯現，亟待解決[1]。顆粒細胞是卵泡發育和閉鎖過程中最重要的參與細胞,通過與卵泡膜相互作用以維持正常的卵巢功能[2]。研究中我們發現miR-223在卵巢顆粒細胞中表達，文獻資料顯示miR-223與IGF-1R基因存在靶向調控作用[3]，目前尚無miR-223通過靶向下調IGF1R-AKT/mTOR通路對卵巢顆粒細胞增殖及其凋亡產生影響的文獻資料報道，為進一步驗證這一假設，我們設計了本次研究，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本研究于2019年6月-2019年12月在寧夏醫科大學生育力保持教育部重點實驗室完成，人卵巢顆粒細胞購自ATCC公司，miR-223慢病毒購自VectorBuilder公司，蛋白抗體購自北京博奧森生物技術有限公司(IGF1R兔抗人抗體，bs-4985R；p-S6K1兔抗人抗體，bs-5669R；p-4EBP1，bs-14550R;山羊抗兔二抗，bs-0295G-HRP)。實驗依據細胞處理方式分為以下3組：①正常對照組為細胞常規培養；②慢病毒對照治療組為正常對照組細胞轉染對照慢病毒；③miR-223 Mimics組(Mimics組)為正常對照組細胞轉染miR-223 Mimics慢病毒，各組細胞于慢病毒轉染72 h后收集細胞進行后續實驗，每組3個重復。

1.2 細胞培養：SVOG細胞培養液為1 640培養液+10%胎牛血清+1%雙抗。培養條件：37 ℃恒溫培養箱，95%空氣+5%二氧化碳。細胞融合80%左右按1∶3進行傳代。

1.3 CCK8細胞增殖檢測：采用0.25%胰酶消化收集各組細胞，細胞計數板計數，然后將上述各組細胞分別接種于96孔板中，每空104個細胞，每組3個重復。接種后0、24、48 h加入100 μl含10% CCK8工作液的完全培養液，37 ℃培養箱孵育2h后，取出96孔板，采用酶標儀檢測各孔細胞OD值。

1.4 Western Blot檢測：采用0.25%胰酶消化收集各組細胞，參照全蛋白提取試劑盒(凱基KGP250)操作流程提取各組細胞蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒(凱基KGPBCA)檢測蛋白濃度，配置SDS凝膠，每組蛋白上樣量30 μg，電泳、轉膜，3% BAS封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜(IGF1R,1∶1 000；p-S6K1,1∶1 000；p-4EBP1,1∶1 000)。第2天洗膜，二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，再洗膜，ECL發光檢測，蛋白表達檢測采用ImageJ軟件檢測條帶灰度值后進行統計學分析，每個樣本重復3次。

1.5 流式細胞儀細胞周期檢測：0.25%胰酶消化收集各組細胞，細胞計數板計數，每組分別取106個細胞，75%乙醇固定過夜，PBS溶液離心洗滌3次(800 g，5 min)，采用細胞周期檢測試劑盒(凱基KGA511)配置PI/RNase A 染色工作液，每個樣本加入500工作液，4 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀上機檢測，每組3個重復。

1.6 Q-PCR檢測：0.25%胰酶消化收集各組細胞，參照Trizol總RNA提取試劑(凱基KGA1203)操作說明提取各組細胞RNA，檢測RNA濃度，逆轉錄，采用ABI 7500熒光定量PCR進行檢測。各基因PCR用2-△△CT計算各基因RNA的相對表達量，見表1。

表1 各基因Q-PCR序列信息

2 結果

2.1 人卵巢顆粒慢病毒轉染效果：慢病毒轉染后Q-PCR檢測，miR-223表達量正常對照為(1.00±0.091)，慢病毒對照組為(0.997±0.123)倍，Mimics組為(3.857±0.215)倍，Mimics組miR-223表達顯著上調(F=351.87，P<0.05)，Mimics組與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.2 各組細胞CCK8細胞增殖檢測:CCK8細胞增殖檢測結果顯示,Mimics細胞24、48 h OD值與正常對照組比較差異具有統計學意義(t24=14.86，t48=27.26，P<0.05),見表2。

表2 各組細胞CCK8細胞增殖檢測比較

2.3 各組細胞周期分析：流式細胞儀細胞周期分析結果顯示，Mimics組細胞與正常對照組比較差異有統計學意義，其中Mimics組G1期細胞比例高于對照組，S期、G2期細胞比例低于正常對照組，差異具有統計學意義(tG1=15.09，tS=6.39，tG2=28.88，P<0.05)，見表3。

表3 各組細胞周期分布比較

2.4 各組細胞凋亡檢測:流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，Mimics組細胞凋亡率高于正常對照組，差異具有統計學意義(t=17.45，P<0.05)，見表4。

表4 各組細胞凋亡率比較

2.5 IGF1R-AKT/mTOR通路基因Western-Blot、Q-PCR檢測：IGF1R-AKT/mTOR通路基因Western-Blot、Q-PCR檢測結果顯示Mimics組IGF1R基因mRNA、蛋白表達較正常對照組下調，差異具有統計學意義(tmRNA=36.93，t蛋白=11.16，P<0.05),且p-S6K1、p-4EBP1蛋白含量較正常對照組減少(tp-S6K1=10.55，tp-4EBP1=9.55，P<0.05)，見圖1(目錄后)。

3 討論

生殖衰老是困擾現代女性的一大問題,女性生育力隨著年齡增長逐漸下降,在30歲后尤為顯著,在35～40歲下降加速,至45歲幾乎降為零[4]。卵巢功能及其微環境穩態與女性生殖衰老息息相關,卵巢顆粒細胞的生長分化恰恰是卵泡的主要構成成分，顆粒細胞表面包含大量受體且能夠分泌雌激素、孕激素等多種具有生物活性的激素，進而促進原始卵泡啟動、生長為成熟卵泡[5]。有研究發現，卵巢顆粒細胞的異常凋亡或是其基因表達異常，與多囊卵巢綜合征患者卵泡發育障礙及雄激素水平異常及卵巢早衰密切相關[6]，為此卵泡中顆粒細胞數量及其功能對女性生殖功能具有重要影響[7]。

miRNA為人體內相對保守的內源性非編碼RNA,其參與調控基因組中半數以上功能基因的表達，miRNA通過與靶基因轉錄產物mRNA的3’-UTR結合,引起靶mRNA的降解進而阻礙靶基因翻譯，腫瘤學研究表明miRNA參與所有惡性腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移等過程[8]。胰島素樣生長因子1 (IGF-1R) 是一種多肽類生長因子,IGF-1R在細胞生長、分化、轉移、凋亡等多種生命活動中扮演著重要角色[9]。相關研究表明，IGF1R所含的酪氨酸激酶結構域可以激活下游的PI3K/AKT/mTOR通路，該通路通過促進其下游底物S6K1蛋白和4EBP1蛋白磷酸化,進而增強細胞蛋白質的合成,促進細胞的增殖、遷移和抑制細胞凋亡[10-11]。

本次研究發現人卵巢顆粒細胞中上調miR-223表達，顆粒細胞增殖受到抑制，細胞出現G1期阻滯，同時顆粒細胞凋亡率增加，Western-Blot、Q-PCR檢測結果顯示上調miR-223表達，IGF1R基因mRNA、蛋白表達均下調，同時mTOR通路下游p-S6K1、p-4EBP1蛋白含量減少，說明IGF1R-AKT/mTOR通路活性被抑制。

綜上所述，本研究驗證了miR-223通過靶向下調IGF1R基因表達進而下調AKT/mTOR信號通路抑制卵巢顆粒細胞增殖及促進凋亡。研究為卵巢顆粒細胞損傷的相關機制研究提供了新的思路。