脂肪乳對有機磷農藥中毒大鼠肝損傷的保護作用研究

胡小東，周 春 ,康向飛，李文峰

有機磷中毒是全球最重要的急性中毒公共衛生事件，我國也是有機磷中毒高發國家之一[1]。目前，雖然相關解毒劑和血液灌流等治療措施應用可以有效挽救患者生命，但是嚴重有機磷中毒患者死亡率依然很高[2]。在嚴重有機磷中毒中肝臟是主要損傷器官之一，也是導致死亡的主要原因，因此探索肝保護解毒藥物能夠為治療有機磷中毒提供有效手段[3]。脂肪乳作為一種靜脈注射制劑已經成為預防、治療局麻藥中毒的首選用藥[4]。有研究發現脂肪乳劑對有機磷中毒肝損傷具有一定的保護作用，但是其具體作用機制還不明確，因此，本研究擬評價20%脂肪乳劑對有機磷中毒肝損傷的治療作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料：2019年3月-2020年5月選擇由寧夏醫科大學動物實驗中心人工培育的供實驗用Wistar大鼠60只，雌雄各半，體重為200～240 g。實驗前大鼠在動物室內自由飲食飲水，光照12 h，明暗交替，保持室溫22～26 ℃，濕度50%～60%，適應性喂養1周，實驗前隔夜禁食。

1.2 模型制備:將大鼠按隨機數字表法分為對照組(玉米油+0.9%生理鹽水)、模型組(馬拉硫磷+0.9%生理鹽水)和治療組(馬拉硫磷+20%脂肪乳)，每組20只大鼠。模型組和治療組通過灌胃途徑給予100 mg/kg馬拉硫磷(基于LD50和體重計算馬拉硫磷的劑量，雄性Wistar大鼠的LD50為1 768～1 857 mg/kg)。同時對照組通過灌胃途徑給予同體積的玉米油。

1.3 藥物治療:馬拉硫磷灌胃10 min后，治療組通過尾靜脈給予3 mL/kg的20%脂肪乳；同時對照組和模型組通過尾靜脈給予3 mL/kg的生理鹽水。實驗執行期間所有實驗動物均正常飲水飲食。

1.4 組織取材:給藥后12 h進行組織取材。腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)麻醉動物，迅速經腹主動脈采血，所有血液均置于肝素抗凝采血管中，血樣經3 500 r/min離心5 min，收集上清血漿按整體積分裝于凍存管中，血漿樣本經液氮迅速冷凍后儲存于-80 ℃冰箱中待檢。之后動物在麻醉下死于失血，取出肝臟，冷卻的生理鹽水洗滌，在濾紙上吸干多余水分和血液，稱取整體肝臟并將其立即切成兩半，一半固定在4%多聚甲醛中，另一半經液氮迅速冷凍后儲存于-80 ℃冰箱中待檢。

1.5 檢測指標:采用邁瑞全自動化學發光測定儀CL-900i全自動免疫分析儀及其配套試劑盒檢測血清樣本ALT和AST表達水平，將-80 ℃冰箱保存的肝組織研磨、裂解、離心后提取上清液進行肝組織MDA、SOD和GSH表達水平檢測(采用酶聯免疫吸附法進行檢測，試劑盒購于上?？道噬锟萍加邢薰?，所有檢測嚴格按照相關試劑盒操作指南進行。取肝臟左葉組織，按照HE染色操作步驟進行組織處理后，光鏡下觀察肝臟病理改變。采用Western blot方法觀察肝臟組織中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達情況。將-80℃冰箱保存肝組織經研磨、裂解、離心后提取總蛋白，12 000 r離心20 min，收集上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。按5份樣品體積與1份loading buffer混勻，100 ℃ 孵育3 min，上樣體積為10～20 μl，經5%～12%SDS-PAGE分離樣品后將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶粉封閉2 h，按操作加入相應的一抗(GAPDH抗體1∶800、Bcl-2抗體1∶1 000、Bax抗體1∶1 000、Caspase-3抗體1∶1 000)及適當稀釋倍數的二抗。凝膠成像系統攝相分析。以GAPDH作為內參，用靶蛋白積分吸光度(IA)值/GAPDH(IA)值顯示靶蛋白相對水平。所有抗體均購自Cell Signaling Technology公司。

2 結果

2.1 各組大鼠生化指標比較:大鼠肝組織中GSH、CAT和SOD表達水平治療組與模型組相比明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；治療組MDA水平與模型組相比顯著下降，差異具有統計學意義(P<0.05);治療組大鼠血清ALT和AST表達水平與模型組相比也明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠生化指標比較

2.2 各組大鼠肝組織病理學改變情況:模型組大鼠肝細胞排列紊亂，出現竇狀擴張，并發生球囊變性。實質內也有局灶性單核細胞聚集。治療組大鼠肝細胞損傷減少，肝細胞有規律地排列在血竇旁，見圖1-圖3(封二)。

2.3 各組大鼠Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達與GAPDH比值情況:治療組大鼠肝組織中Bax和Caspase-3蛋白表達與模型組相比明顯減少，而Bcl-2蛋白表達明顯增加，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2和圖4(封二)。

表2 各組大鼠Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達與GAPDH比值情況

3 討論

脂肪乳對有機磷農藥肝損傷保護作用。有機磷農藥主要在肝內轉化代謝，當超過肝的解毒能力范圍時，就會對肝臟線粒體和內質網等重要細胞器造成影響，從而導致細胞功能紊亂和死亡[5]。有研究表明，有機磷化合物可誘導肝細胞線粒體發生氧化應激，導致線粒體功能衰竭，進一步誘發細胞凋亡，加重了肝損傷[6]。同時有機磷農藥增加了肝細胞中Caspase-1、Caspase-3和p53基因的表達水平，并在門靜脈區域觀察到組織病理學上淤血和壞死的改變[7]。在對有機磷農藥暴露者的研究發現，有機磷農藥中毒者的膽堿酯酶和抗氧化劑(GSH)水平降低，而MDA和Caspase-3活性增加[8]。

我們的研究中發現馬拉硫磷可以使大鼠肝組織中GSH和SOD酶活性降低，而MDA酶活性升高。同時凋亡蛋白Bax和Caspase-3蛋白表達明顯增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯減少。這進一步表明有機磷農藥中毒肝損傷可能與氧化應激誘導細胞凋亡有關。我們給予脂肪乳劑治療后可以使GSH和SOD酶活性表達明顯升高，同時降低MDA酶活性(P<0.05)。脂肪乳劑治療后降低了大鼠肝組織中凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達，升高了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達 (P<0.05)。有機磷農藥增加肝臟組織的氧化應激，通過激活細胞凋亡的內在途徑，極有可能導致Bax和Caspase3免疫反應活性的增加。除氧化損傷外，通過抑制線粒體呼吸復合物，有機磷農藥也可能是觸發細胞凋亡的一個額外的內在因素[9]。對有機磷農藥中毒大鼠來說，脂肪乳劑除作為一種能量來源外，還可以通過進一步抗氧化和抗凋亡作用提供一種新的保護機制，組織病理學改變也表明脂肪乳劑能改善有機磷農藥對肝組織的損傷程度。

在脂肪乳劑關于局麻藥物解毒的研究中，其主要作用機制被認為是通過脂肪吸附效應，將有毒物質從機體中分離，從而降低毒性損傷發揮作用[10]。同時也有學說認為脂肪乳劑改善線粒體代謝，增加線粒體內脂肪酸的濃度，恢復細胞的能量供應，增加ATP合成也可能是脂肪乳劑解毒的作用機制[11]。關于脂肪乳劑治療有機磷中毒的臨床研究表明，脂肪乳劑對有機磷中毒患者的治療是安全的，無血流動力學參數變化及不良反應發生[12]。一項脂肪乳劑對有機磷中毒患者的療效及預后薈萃分析也表明，脂肪乳劑有助于改善有機磷中毒患者的預后和肝功能[13]。急性有機磷中毒救治的專家共識雖然沒有明確推薦脂肪乳劑用于有機磷農藥中毒治療[1]，但是目前普遍認為其可能是一種有效的治療手段，只是缺乏足夠的臨床證據支撐。在我們的研究中，通過馬拉硫磷制備有機磷中毒大鼠模型，給予脂肪乳劑后可以顯著逆轉肝臟組織的組織學損傷。此外，我們發現脂肪乳劑治療后細胞凋亡減少，這可能是脂肪乳劑與馬拉硫磷結合降低了循環中馬拉硫磷的游離水平，同時改善了肝臟線粒體代謝，減少了氧化應激和炎癥損傷。

綜上所述，脂肪乳劑對有機磷農藥中毒肝損傷具有治療作用,其作用機制可能與脂肪乳劑與馬拉硫磷結合后阻止其進入肝臟實質中，從而抑制了細胞凋亡活動，減少了馬拉硫磷的代謝量有關。除脂肪吸附理論外，脂肪乳劑還可能通過減少氧化應激和炎癥反應刺激保護線粒體等重要細胞器，為細胞產生大量能量。為了進一步探討脂肪乳劑在機體內與有機磷農藥結合的多少，還需要進一步進行研究。