生物散斑激光技術無損檢測原理及在食品中應用效果研究進展

馮 佳，李新宇，楊欣悅，李 瑩，趙夢娜，任 靜，夏秀芳

（東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030）

新鮮果蔬和肉是人體健康所必需的主要營養來源。但是新鮮農、畜產品極易腐爛，貨架期短，且在裝卸、運輸和加工過程中非常容易變質，這嚴重損害了消費者的經濟利益和健康。因此，對農、畜產品進行質量檢測極為重要。食品無損檢測是指在不傷害或不影響食品食用性能的前提下,利用光、聲、電、磁和力等原理對食品進行缺陷、化學和物理參數的測定[1]。因其具有傳統檢測技術無法比擬的非破壞性、可對同一樣品進行多次重復檢測等優勢，其在食品質量與安全檢測中的應用日漸廣泛[2]。

由于無損檢測具有傳統檢測技術無法比擬的優勢，其在食品質量與安全檢測中的應用日漸廣泛。其中基于光學的無損檢測技術主要是通過食品對光的反射、吸收以及散射等特性實現對食品品質的檢測，包括機器視覺[3]、近紅外光譜[4]、高光譜成像[5]和生物散斑激光技術等。這些技術已被廣泛應用于食品檢測中，使得食品質量與安全檢測得到了質的提升[6]。機器視覺是從外觀特征對樣品進行定性判別，而無法反映其內部信息[7]；近紅外和高光譜技術可實現樣品某些指標的定量分析，但設備成本較高，且近紅外技術模型建立要以大量化學測定為基礎、分析結果的準確性易受外界因素影響，高光譜技術在數據處理量、檢測分析速度方面仍然有待改進[8]。生物散斑激光技術基于相干光照射在活性材料表面形成的動態散斑來獲取生物信息，從而實現對樣品的分析和檢測[9]，相比于上述技術，生物散斑激光技術不僅可以達到相同的檢測效果，同時還具有對樣品破壞性小、成本更低、可快速檢測、同時實現對樣品的實時在線定性及定量分析并且能夠反映樣品外部品質、營養成分及內部品質的諸多優勢，在食品質量與安全檢測中具有極強的市場競爭力。

本文介紹了生物散斑激光技術的基本原理，并對該技術在農、畜產品無損檢測中應用的研究進展進行了綜述，總結了其在食品質量與安全檢測中的優勢及缺陷，旨在為生物散斑激光技術在農、畜產品方面的廣泛應用提供理論參考。

1 生物散斑激光技術

1.1 生物散斑激光技術基本原理

生物散斑激光技術是基于對激光照射生物材料產生的散射光的研究過程[10]（圖1）。當激光照向生物材料時，經過包括空氣空間、皮膚、纖維、細胞壁在內的一層或者多層組織的散射，最終在觀測平面形成由亮斑和暗斑組成的隨機顆粒狀圖案[11]。其中亮斑是粒子散射光以同一相位到達屏幕相互疊加形成的可變圖案，被稱為生物散斑[12]。生物散斑可以反映食品所處的狀態，它的變化與食品內部物理和化學成分在時間和空間上的不穩定性及其內部組織結構的不均勻性有關[9]。

圖1 生物散斑激光技術原理圖[13-18]Fig.1 Schematic diagram of biospeckle laser technique[13-18]

1.1.1 物理特性 從物理上來講，生物散斑活性與生物材料成熟和生化反應過程中的細胞質流、細胞器運動、細胞生長和分裂有關[19]：細胞器和隨水流運動的溶解大分子是散射中心，可以引起動態光散射；根據酸生長理論的研究，在生長過程中，果蔬纖維素分解酶的排泄使細胞壁松弛，膨脹壓力增加，這可能是動態光散射的直接來源，另一方面，農產品成熟或損傷過程中伴隨著細胞壁降解的化學變化，導致組織的光譜特性朝著更大的光吸收方向變化，這可能會減少擴散反射光的數量，從而降低生物散斑動力學[20]。此外，布朗運動也應該被認為是生物散斑活動的來源[21]。

1.1.2 化學成分 在果蔬中，生物散斑的表觀活性是細胞內粒子物理運動的結果，并受組織色素對光吸收變化的影響[22]。生物散斑的研究通常采用紅色激光，這一光波可被葉綠素吸收，因此含有葉綠素的物質其光傳播和生物散斑活性都會受到影響。果蔬在成熟過程中生物散斑活性的增強與其體內葉綠素的降解有關[23]：葉綠素的降解會導致光吸收率降低，進一步導致激光穿透更深，照明光斑尺寸增加，照明體積增大，散斑顆粒尺寸變小，粒子運動加快，散射光斑強度快速波動；另一方面，生物材料內部散射粒子數量增加，生物散斑活性增強。還有研究表明，樣品生物散斑活性的大小還與類胡蘿卜素含量有關[24]。此外，Zdunek 等[25]還研究發現，果蔬的生物散斑活性與淀粉含量呈顯著正相關（R=0.849），這是由于在果實成熟過程中淀粉降解為碳水化合物，可溶性固形物含量（Soluble solid content，SSC）增加，組織內散射粒子數量增加所致。

肉在冷藏過程中，隨著時間的變化，由于酶解及微生物的作用，蛋白質大分子降解為氨和胺類化合物等小分子堿性含氮物質，即揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）的含量上升[26]，也會引起組織散射中心散射粒子粒徑及數量的變化，進而引起散斑活性改變。

1.1.3 內部組織結構 光散射特性與微生物運動有關,微生物運動速度越快，生物散斑活性越高[20]，可以以此來檢測果蔬內部微生物感染情況。在肉組織中，光散射會發生在其內部肌纖維、結締組織與脂肪組織及周圍間質粒子之間折射率不連續的邊界上，而這些組織的分布情況、分布數量等正是影響肉嫩度的最重要的因素[27]，因此，光散射特性可以作為肉嫩度檢測的潛在指標。此外，Isis 等[28]研究發現，生物散斑活性與肉的顏色也有很強的相關性，這可能與肉色變化引起的光吸收率的改變有關。

1.2 生物散斑激光技術測量

1.2.1 生物散斑激光技術測量過程 生物散斑激光技術測量裝置較其他檢測成像設備簡單，其基本設備通常包括激光器、擴束-準直系統、接收圖像的電感耦合器件（charge coupled device，CCD）、進行圖像處理的PC 等[29]。依據擴束-準直系統的不同，生物散斑激光技術常用測量裝置有三種（圖2）[30]。

圖2 生物散斑激光技術裝備示意圖[30]Fig.2 Schematic diagram of biospeckle laser technique equipment[30]

1.2.2 數據處理方法 傳輸到PC的原始散斑圖像經過相應圖像化或者數字化處理可以實現對樣品的定性及定量分析[31]（圖1）。生物散斑激光技術常用的圖像化處理方法包括Fujii、GD、THSP、COM，其中Fujii 和GD 是通過處理后散斑圖像上顏色的不同來區分不同活性區域或者不同活性樣本，THSP 通過散斑圖案的平穩程度來衡量散斑活性的大小，COM 通過非零值在主對角線的擴散程度來定性分析散斑活性；IM、AVD、相關系數是常用的數字化處理方法，通過一定的數字化處理將生物活性量化。

2 生物散斑激光技術在農、畜產品質量和安全檢測方面的應用

近年來，生物散斑激光技術在農、畜產品質量與安全檢測方面的應用已經較為廣泛，主要表現在農、畜產品成熟度監測、新鮮度監測以及品質檢測中。

2.1 生物散斑激光技術在農、畜產品成熟度監測中的應用

2.1.1 在水果成熟度監測中的應用 生物散斑激光技術可以通過對SSC、硬度、淀粉含量（starch content，SC）等的無損評價來確定水果成熟度，進一步預測水果最佳采收期。Szymanska-Chargot 等[32]分別采用生物散斑激光技術和常用理化檢驗對樣品進行分析，結果發現蘋果在成熟過程中生物散斑活性值（biospeckle activity，BA）和SSC（R=0.91）、SC（R=?0.80）及硬度（R=?0.89）均有很強的相關性。在此基礎上，Anna 等[33]還進一步發現BA 與Streif 指數及蘋果內部發生的生理變化均有良好匹配。除此之外，對水果采前成熟度的預測在芒果[34]、macaw palm 果實[35]、香蕉[36]上也得到了證實。

生物散斑激光技術也可通過生物散斑活性與貯藏時間的相關性用于水果采后階段成熟度的無損評價，預測水果貨架期。Ansari 等[22]先后對蘋果、梨[22]及檸檬[37]進行了研究，研究指出，這幾種水果的生物散斑活性在果實的不同成熟階段均有所不同，由此可以確定果實的生理年齡，預測其貨架期。

2.1.2 在蔬菜成熟度監測中的應用 生物散斑激光技術可以通過對硬度、葉綠素含量、類胡蘿卜素含量的無損評價來預測蔬菜成熟度。Romero 等[38]揭示了番茄在成熟過程中葉綠素的降解與散斑活性變化和散射光強度變化之間的關系。Piotr 等[24]指出，在640 nm 激光波長下，“starbuck”品種番茄的生物散斑活性（特征值ε）與番茄硬度（R2=0.93）、葉綠素（R2=0.91）和類胡蘿卜素含量（R2=0.85）顯著相關；實驗還通過標準光學測量（色度C*、紅度值a*/黃度值b*和亮度L*）驗證了生物散斑成像的性能。

2.1.3 在肉成熟度監測中的應用 肌肉在成熟過程中發生的肌肉纖維斷裂、肌節減少、細胞核變形、核染色質減少、線粒體破壞等一系列生化變化會導致其生物散斑活性水平的降低。Maksymenko 等[39]研究表明，肌肉在屠宰之后發生這一系列生化變化會導致冷凍肌肉CBAM（coefficient of biospeckle activity，CBA）的單調下降。

生物散斑激光技術還可以通過表征肉的嫩度、顏色等外部品質的變化來評價和預測肉品質量。Isis 等[28]研究表明，牛肉在成熟過程中AVD 值與Warner-Bratzler 剪切力(Warner–Bratzler Shear Force，WBSF)（R=0.615）、h*（R=0.795）、a*（R=0.812）、b*（R=0.912）均有較強相關性。董慶利等[40]也得到了相同的結果：IM 對牛肉硬度、咀嚼性及WBSF的預測決定系數分別為0.83、0.77 和0.69。

2.2 生物散斑激光技術在農、畜產品新鮮度監測中的應用

采用生物散斑激光技術，可以通過IM 值預測蛋白質分解、水分含量及肉色變化等多種生化變化來監測肉的新鮮度。肉新鮮度的傳統測量方法為半微量定氮法，采用這種方法測量肉制品中TVB-N的含量，據此對豬肉的新鮮度進行等級劃分。采用生物散斑激光技術可以實現對肉新鮮度更加快速、方便、準確的無損測量。劉夢雷等[41]發現：在465 nm 激光波長下，肉的新鮮程度與散斑活性有關；依據肉類新鮮度等級劃分標準，采用線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）對測得的TVB-N 值和散斑活性IM 值建立豬肉新鮮度等級預測模型得到的訓練集和預測集識別率均高于87%，其中IM 值對不新鮮豬肉的識別效果更好，其訓練集識別率達到了100%。之后，他們還進一步探究發現生物散斑活性與豬肉中水分含量及肉色之間也有很強的相關性。

2.3 生物散斑激光技術在農、畜產品品質檢測中的應用

2.3.1 化學殘留物檢測 因為蔬菜腐爛速度快，保質期短，因此蔬菜的保存是一直以來的研究熱點。在蔬菜中添加化學殺蟲劑和人工防腐劑，可以有效延長其貨架期和成熟期，但是這些物質的添加會極大降低蔬菜的質量，表現為動態散斑活性的降低。Samuel 等[42]研究發現：相比于正常樣品，浸泡過化學殺蟲劑的黃瓜樣品，雖然貨架期和保質期延長，但其品質下降，動態散斑活性降低了15%。

2.3.2 摻假檢測 摻假也是食品工業面臨的重要挑戰，生物散斑激光技術可以克服現有食品摻假檢測技術耗時耗力、靈敏度低的缺點，用于食品的無損定量分析。賈桂鋒等[43]將新鮮牛肉和非新鮮牛肉按不同梯度比例混合制備摻假樣本并測量其生物散斑活性，結果發現IM 譜中高平峰區的左側結束點隨著摻假濃度的升高向右側移動，即摻假濃度越高散斑活性越低，且基于IM 譜建立的支持向量回歸機（support vector regression machine，SVR）校正集和測試集的決定系數均高于0.81，均方根誤差分別為0.12 和0.11，效果良好。

2.3.3 損害監測 水果在成熟過程中受環境條件影響可能會發生損害，利用生物散斑激光技術可以通過活性圖或者活性值的改變分辨正常水果和受損水果甚至對不同損傷程度的水果進行分類。Rahmanian 等[44]模擬了不同條件下的柑橘，結果發現，相對于正常柑橘，冷卻條件下柑橘的生物散斑活性較高，冷凍條件下柑橘的活性水平較低，其中極端冷凍條件下柑橘組織細胞死亡，活性水平接近于零，采用Fujii 獲得的活性圖也表現出相同的結果；此外，依據COM 中提取的變量運用人工神經網絡分類模型（artificial neural networks，ANN）對四種柑橘進行分類得到的準確率達到100%，這可為實現柑橘自動分級提供理論依據。

蔬菜和水果的柔軟表皮在收獲和收獲后的操作中容易受損，其表面的機械損傷是微生物入侵的重要港口，會導致產品質量下降，不僅如此，受損產品還會進一步導致其他產品的快速腐爛，危及食品安全，因此，對這類果蔬的正確鑒別具有重要意義。發生機械損傷的果蔬生物散斑活性會改變，Pajuelo 等[45]初步研究發現，蘋果在鋼球撞擊前后相應自相關函數的累積量在t檢驗中存在顯著性差異（P<0.001）。Samuel等[42]進一步研究指出，正常蘋果和由于外力受損蘋果的互相關百分比相差約25%～30%，橙子在受到應力后，相關性增加，且互相關值與水果的受損程度呈負相關；采用GD 法可以將正常水果和受損水果之間的散斑活性差異變得可視化。Anderson 等[46]發現：AVD 值與馬鈴薯淤傷所導致的漸變性褐變有顯著相關性（r=?0.79），區域暗度的增加及外力影響與生物散斑活性的下降有關，且在機械撞擊發生4 h 后即可檢測到其內部瘀傷。

生物散斑激光技術可以通過生物散斑活性與水果貯藏狀態的相關性實現對不同狀態水果的定量無損分析。水果在貯藏過程中根據其質地柔軟程度及多汁性可以分為新鮮水果、半粉水果和粉水果。Arefi 等[47]發現，新鮮蘋果的IM 值和AVD 值均顯著高于半粉蘋果和粉蘋果（P<0.05），依據傳統粉水果測量（限制性壓縮實驗）分類方法，采用AVD 值對三種品質的蘋果進行分類準確率高于70%。之后，他們進一步研究發現，基于THSP 中提取出來的圖像紋理特征的ANN 對新鮮和粉蘋果的分類準確率又有所提升，均高于86%[48]。

2.3.4 微生物感染檢測 感染了活性真菌和細菌的食品，其貯藏和貯藏后品質會急劇降低，生物散斑活性相對健康食品較高。Pieczywek 等[49]及Adamiak等[50]研究表明：假單胞菌接種后三天，健康組織和感染組織散斑活性相差約40%；Fujii 和互相關法均能夠在接種后的第一天檢測到蘋果中牛眼腐病的感染，這比葉綠素熒光方法提前一天，而僅憑肉眼觀察在接種后第四天才能觀察到蘋果表面真菌的生長，極大地提高了檢測效率，并且相比于高光譜技術，其譜圖也更為清晰。以上研究結果表明，生物散斑激光技術在食品微生物感染檢測中應用效果較好。

3 生物散斑激光技術特點

生物散斑激光技術作為一種新興的食品質量與安全檢測技術，具有無損、檢測效率高、應用范圍廣等優勢，但同時也存在穩定性差、穿透深度淺等缺陷。

3.1 無損

生物散斑激光技術的主要優點是不用探頭接觸樣品，可以在不破壞其物理完整性的情況下對樣品進行檢查[51]。另一方面，該技術所使用的激光器通常為低功率He-Ne 激光器，功率為mW 級別，光斑直徑范圍為1 mm～10 cm[20]，輻照強度為每平方厘米僅為毫瓦級，屬于低強度激光/弱激光，這種激光常在生物醫學中用來做生理刺激源[52]，不會對研究樣品直接產生不可逆損傷。

3.2 檢測效率高

在檢測過程中，生物散斑激光技術通過相機曝光來獲得散斑視頻序列，依據相機捕獲速度的不同，10 s 即可獲得包括300～600 張散斑圖像在內的8 位視頻序列；生物散斑激光技術還可以在外部損傷不可視的情況下即檢測到由其引發的生物活性的改變[31]，以便快速了解樣品所處的狀態，檢測效率大大提高。即使是在檢測完成后，生物散斑激光技術所需要的數據測量及后處理耗時也相對較少。

3.3 應用范圍廣

生物散斑激光技術可以通過對初始散斑圖像進行圖像化或者數字化分析，實現對樣品的實時在線定性、定量無損監測；在檢測過程中可以與多個指標建立相關性，這可能可以從多維度評價食品的一個或者多個特性，從而實現對食品綜合品質的評價，滿足更大的檢測需求。

3.4 穩定性差

采用生物散斑激光技術進行分析時，容易受到光線以及噪聲的干擾。光線的干擾可以通過在黑暗環境下實驗解決，而噪聲問題可以通過快速測量的方法解決，即只使用一幅圖像或一小組圖像，也可結合濾波的方法進一步抑制噪聲的產生，以得到更加清晰、細節更加豐富的散斑圖[53]。

3.5 穿透深度淺

激光對樣品的穿透能力一定程度上也限制了它的應用。例如，He-Ne 激光在蘋果皮中的穿透深度只有2 mm[54]，在蘋果組織中只有7～10 mm[55]。在果實的中心部位很難獲得生物散斑活性，并且農產品的表面特性也會影響生物散斑活性，因此可能會對實驗結果造成一定的影響。

4 結語與展望

生物散斑激光技術具有低成本、非接觸、可應用于多種固態食品等諸多優勢，是食品質量監控和安全檢測的有效工具。目前，對該技術的研究雖然已經取得較大進展，但在食品領域應用方面卻仍處于基礎研究階段，在今后的開發、利用中，還有許多問題亟待解決：

生物散斑激光技術在農、畜產品中的應用已經得到了較為廣泛的研究，但各指標與生物活性之間相關性的機理還未能得到深入揭示，可進行深入研究；同時還可以通過機理的揭示進一步發現生物活性與更多指標之間的相關性，從而進一步拓寬生物散斑激光技術在食品無損檢測中的應用范圍。

目前生物散斑激光技術檢測范圍還較為局限，之后可將生物散斑激光技術與其他無損檢測技術如近紅外光譜、機器視覺技術等有機結合，充分利用多元信息，使食品質量得到更加簡單、快速、準確、全面的評價。

生物散斑激光技術在農、畜產品中的應用目前還局限于實驗室階段，之后可以開發便攜裝置，通過建立數據庫，實現對食品的快速、無損檢測。