微生物產蛋白酶的研究進展

艾雨晴，陳松駿，秦 娟，于 雙，李 萌，趙前程，李 瑩（大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧大連 116023）

蛋白酶是能夠水解蛋白質中肽鍵結構，產生氨基酸或多肽的一類酶的總稱，是一種重要的工業酶，在全球酶總產值中占60%左右[1?2]，廣泛應用于食品、醫藥、洗滌及飼料等領域[3]。蛋白酶分布廣泛，種類繁多，根據酶對底物作用方式的不同，可以將其分為內肽酶與外肽酶。內肽酶從蛋白質的內部切割肽鍵，產生小分子的蛋白?或蛋白胨，外肽酶則從蛋白質的-COOH 或-NH2端逐個切割，產生游離氨基酸，用于工業生產的蛋白酶以內肽酶為主[4]。根據酶的活性中心不同，可以將蛋白酶分為天冬氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶[5]。根據酶反應的最適pH 不同，可以將蛋白酶分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。根據蛋白酶的來源不同，又可以將蛋白酶分為動物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶，與動植物蛋白酶相比，微生物蛋白酶具有種類豐富、不受原料限制、提取工藝簡單，易于實現工業化生產等優點，因此，微生物產蛋白酶已成為蛋白酶制劑的主要來源，工業上超過三分之二的蛋白酶來自于微生物發酵生產[6?7]。近年來，新型蛋白酶的發掘、高產蛋白酶菌株的選育、蛋白酶的改性仍是國內外研究的熱點[8?9]。本文分別從微生物產蛋白酶的工業化生產菌種、高產菌株的選育、酶學性質、分離純化方法及在食品行業中的應用五個方面進行梳理總結，闡明了微生物蛋白酶的研究現狀及發展方向，為進一步研究和發掘微生物產蛋白酶，促進蛋白酶的工業化生產奠定基礎。

1 產蛋白酶的工業化生產菌種

產生蛋白酶的微生物種類繁多，作為工業生產應用菌株，需要具備高產、無毒和無致病性等條件[10]。目前，工業上常用細菌、霉菌和放線菌作為發酵生產蛋白酶的菌種[11]，細菌蛋白酶通常采用液體深層培養法進行發酵生產，而霉菌蛋白酶則可采用固態培養法進行發酵生產，微生物產蛋白酶的主要工業化菌株如表1 所示。

表1 產蛋白酶的主要工業化菌株Table 1 The main industrial strains producing protease

工業上酸性蛋白酶的生產菌種主要是霉菌中的黑曲霉、米曲霉和宇佐曲霉，另外，擔子菌和酵母菌也可用于生產酸性蛋白酶[26]。1954 年日本研究員首次發現黑曲霉可以產生酸性蛋白酶，隨后大量霉菌性蛋白酶產生菌被發現[12]。我國上海工業微生物所首次篩選出一株產酸性蛋白酶的黑曲霉菌株3.350，并用于工業生產，填補了我國酸性蛋白酶工業化生產的空白[13]。米曲霉3.042 菌株、宇佐美曲霉537 菌株和宇佐美曲霉L336 菌株也常作為酸性蛋白酶的生產菌株，現有的酸性蛋白酶高產菌株大多是由以上菌株選育獲得[14?17]。

中性蛋白酶可以有效地水解大豆原料中的蛋白質，常用于醬油的釀造，其高產菌株集中在曲霉屬和芽孢桿菌屬，曲霉屬菌株以米曲霉為主[27]，芽孢桿菌屬的菌株包括枯草芽孢桿菌、耐熱解蛋白芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等[28?31]。米曲霉是國際公認的食品安全微生物，其所產生的胞外酶系復雜，在這些酶系中，以中性蛋白酶和淀粉酶為主[30]。米曲霉AS3.951（滬釀3.042）、米曲霉NRRL 1808、米曲霉CICIM F0899 和米曲霉ZW-06 等菌株均能高產中性蛋白酶[18?21]，但不同菌株產生的中性蛋白酶在產酶條件和酶學性質上存在較大差異?？莶菅挎邨U菌和耐熱芽孢桿菌產生的中性蛋白酶是代表性中性蛋白酶，我國工業上采用枯草芽孢桿菌AS1.398發酵生產中性蛋白酶已有多年的歷史[22]。從新疆吐魯番火焰山土壤里分離得到的一株耐熱芽孢桿菌XJT9503，能夠產生高溫中性蛋白酶[31]。于平等[28]從土壤中分離得到一株能夠產新型中性蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌。

可產生堿性蛋白酶的微生物有很多，但用于工業化生產的菌株主要集中在芽孢桿菌屬和鏈霉菌屬，如地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、灰色鏈霉菌、費氏鏈霉菌等[32]。1945年瑞士Jaag 等[33]在地衣芽胞桿菌中發現了堿性蛋白酶，由于其水解能力強且易于工業化生產，因此成為酶學研究領域的熱點。我國最早用于堿性蛋白酶工業化生產的微生物是地衣芽孢桿菌2709[23]，隨后分離獲得的地衣芽孢桿菌C1213、短小芽孢桿菌289及短小芽孢桿菌209 也相繼應用于工業化生產堿性蛋白酶[24?25]。

目前，我國蛋白酶產業日趨成熟，所用的菌株也比較穩定。但常用的工業化生產菌株集中在細菌和霉菌的少數菌屬，種類不夠豐富，使用的菌株及工藝多年來缺少更新，產量與國外相比還有差距。另外，隨著蛋白酶在工業上的廣泛應用，特殊功能蛋白酶的需求日益增加，如嗜熱、嗜冷、耐鹽蛋白酶等。因此，選育現有工業化菌株的蛋白酶產量，尋找并開發新型微生物源蛋白酶，是微生物產蛋白酶的熱點研究方向。

2 高產蛋白酶菌株的選育

能夠產生蛋白酶的微生物種類繁多，但是野生型的菌株蛋白酶產量往往不能滿足工業化生產的需求。因此，通常利用遺傳學的原理和技術，對野生型的菌株進行遺傳改造，以提高蛋白酶的產量，獲得適用于工業化生產的工程菌株[34]。常用的微生物遺傳育種方法包括誘變育種、原生質體融合、基因工程和蛋白質工程育種。

2.1 誘變育種

誘變育種是利用物理或化學因素進行誘變處理，結合高效的篩選手段，獲得高產蛋白酶的突變菌株，前者包括紫外線、激光、X-射線和γ-射線等，后者包括烷基化試劑、堿基類似物和亞硝酸等[35]。舒冬梅等[36]以米曲霉菌株WT415 為出發菌株，經過紫外誘變，其酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶酶活分別提高了14.87%、48.85%和21.47%。除了單因素誘變以外，多因素復合交替誘變能夠擴大突變范圍，往往更能獲得具有優良性狀的突變菌株。劉文龍等[37]采用等離子體和紫外線復合交替誘變黑曲霉LD-015 菌株，經過篩選獲得一株高產突變株，其酶活比出發菌株提高了83.71%，并且遺傳性狀穩定。近年來，一些新型誘變技術，如超臨界CO2、ARTP 和脈沖磁場等，也被用于高產蛋白酶菌株的誘變選育，張咪等[38]用脈沖磁場誘變枯草芽孢桿菌，誘變菌株的中性蛋白酶產量提高了17.7%。

2.2 原生質體融合育種

原生質體融合育種是利用兩個或多個含有不同遺傳性狀的親本，通過原生質體融合使基因發生重組，將親本的優良性狀集中在子代的一種育種技術。潘延云等[39]利用原生質體融合技術，將地衣芽孢桿菌2709 與枯草芽孢桿菌BD105 進行融合，獲得1 株高產堿性蛋白酶的融合菌株A16，其酶活與地衣芽孢桿菌2709 比提高50%。Xu 等[40]以米曲霉HN3042 和黑曲霉CICC2377 為出發菌株進行原生質體融合，獲得了10 株酸性蛋白酶活性提高50%以上的融合株。

2.3 基因工程育種

基因工程育種是利用分子生物學技術，定向改造微生物的遺傳物質，從而創造出更適合工業化生產的工程菌株，廣泛應用于高產蛋白酶菌株的選育。Tang 等[41]將地衣芽孢桿菌2709的堿性蛋白酶基因apr，在枯草芽孢桿菌WB600 中進行表達，獲得重組枯草芽孢桿菌BW-016，其堿性蛋白酶酶活增加65%。Shin 等[42]克隆了麥氏弧菌RH530的堿性蛋白酶基因vapK，將經過DNA 改組的vapK基因轉入麥氏弧菌KS1，構建表達堿性蛋白酶的重組麥氏弧菌，與野生型RH530 菌株相比，堿性蛋白酶活性提高了43 倍。Zhou 等[43]在地衣芽孢桿菌中分別敲除了產孢相關基因sigF和sigE，兩個基因缺失菌株在產蛋白酶方面均表現出優越的性能，最高產蛋白酶量達（29494±1053）U/mL，比野生型菌株高出約19.7%。

2.4 蛋白質工程

蛋白質工程是通過對合成蛋白酶的基因進行有目的的設計和改造，從而改變蛋白酶的初級結構及其特性，該技術是提高蛋白酶的穩定性、專一性和抗氧化性的有效手段。Zhao 等[44]將雙位點突變（W106K/V149I 和W106K/M124L）引入短小芽孢桿菌堿性蛋白酶，提高了短小芽孢桿菌堿性蛋白酶的冷活性和熱穩定性。Nautiyal 等[45]將煙草病毒的蛋白酶C-末端加入一個含有12 個殘基的肽段，重組蛋白酶的溶解度顯著提高，從而增強了酶的活性。Ke 等[46]構建了不含信號肽的截短醬油曲霉GIM3.33 堿性蛋白酶，并在畢赤酵母KM71 菌株中高效表達，重組的堿性蛋白酶具有更加廣泛的底物特異性，是食品工業副產品加工的理想工具。

隨著現代生物技術的發展，菌株的選育已廣泛應用于工業化生產，蛋白酶的產量和質量都有了質的飛躍。各種選育技術之間并不是相互孤立的，而是相互關聯相互交叉的，工業化菌株往往是多種選育技術疊加的產物。近年來，基因工程和蛋白質工程已成為蛋白酶選育和改造的熱點研究方向，在提高蛋白酶產量和改善蛋白酶性質方面，發揮了巨大作用。

3 微生物產蛋白酶的酶學性質

酸性蛋白酶的活性中心通常含有2 個天冬氨酸殘基，其最適pH 往往較低，因此屬于天冬氨酸蛋白酶。微生物產酸性蛋白酶大多來自真菌中的霉菌，細菌中極少存在酸性蛋白酶。不同微生物產酸性蛋白酶對抑制劑的敏感度不同，十二烷基硫酸鈉和重氮酮化合物是主要抑制劑，但通常不受胃蛋白酶抑制劑對-溴苯的抑制[47]。黑曲霉產生的A 型蛋白酶僅被重氮酮化合物部分抑制，而黑曲霉產生的B 型蛋白酶除了受重氮酮化合物抑制外，還受二硫代雙2-硝基苯甲酸及1,2-環-3-對硝基苯氧基丙烷的抑制[48]。酸性蛋白酶最適pH 為2.5～5.0，微生物產酸性蛋白酶反應的最適pH 通常在3.0 左右，如黑曲霉和酵母菌酸性蛋白酶[49]。酸性蛋白酶反應的最適溫度為30～50 °C，如黑曲霉酸性蛋白酶反應的最適溫度為50 °C，在40 °C 條件下酶活力幾乎不受影響，而在70 °C 條件下的相對酶活僅為9.3%[50]。

中性蛋白酶的活性中心往往含有二價鋅離子，因此屬于金屬蛋白酶，活性依賴于其含有的二價金屬陽離子，金屬螯合劑對其具有抑制作用[51]。微生物產的中性蛋白酶是微生物蛋白酶中最不穩定的酶，很容易自溶，大多來自曲霉屬和芽孢桿菌屬。米曲霉中性蛋白酶最適反應pH 和最適反應溫度分別介于7.0～9.0、50～55 °C，耐熱性較差。芽孢桿菌中性蛋白酶最適反應pH 和最適反應溫度分別介于6.8～8.5、40～70 °C，熱穩定性要優于米曲霉中性蛋白酶，少數芽孢桿菌中性蛋白酶能夠耐高溫，如張蕾等[52]分離純化獲得的中性蛋白酶最適反應溫度高達75 °C，是一種細菌耐熱中性蛋白酶。

已發現的微生物產堿性蛋白酶活性中心大多含有絲氨酸，屬于絲氨酸蛋白酶，受二異丙基氟磷酸和苯甲基磺酰氟的抑制，Ca2+能夠激活酶的活性或是穩定酶的結構。Hutadilok 等[53]從芽孢桿菌PS719 中分離純化得到的堿性蛋白酶，受苯甲基磺酰氟、Fe2+和Cu2+抑制，Ca2+能夠激活酶活性。大多數堿性蛋白酶的最適pH 范圍在9.0～11.0 之間，但是微生物產堿性蛋白酶具有更加廣泛的pH 范圍。Fujiwara等[54]在芽孢桿菌B18 中純化出的堿性蛋白酶最適反應pH 為12.0～13.0，在pH 為5.0～12.0 范圍內均能穩定存在。Shanmughapriya 等[55]從海洋玫瑰桿菌MMD040 中分離出的堿性蛋白酶最佳反應pH 為8.0，在pH 為6.0～9.0 范圍內均具有較強活性。大多數堿性蛋白酶最適溫度介于50～70 °C 之間，Lee 等[56]從熱放線菌中分離出來的絲氨酸蛋白酶，最適反應溫度為85 °C，屬于耐熱堿性蛋白酶。Zhu 等[57]從產黃青霉菌中分離出的低溫堿性蛋白酶，最適反應溫度為35 °C，超過50 °C酶活則急速下降。微生物產蛋白酶的酶學性質如表2所示。

表2 微生物產蛋白酶酶學性質Table 2 Enzymatic properties of protease produced by microorganism

微生物產蛋白酶普遍具有穩定性較強的特點，一般適用溫度和pH 范圍較廣，對抑制劑的耐受性較強，因此，微生物產蛋白酶應用范圍很廣，涵蓋洗滌劑配方、皮革加工、谷物壓榨、釀造、食品加工等眾多領域。微生物產蛋白酶能夠廣泛應用于各行各業的另一因素是其生產成本低，而成本除受蛋白酶產量的限制外，還受蛋白酶的分離純化難易程度限制。

4 微生物產蛋白酶的分離純化

商品化的蛋白酶往往需要較高的純度，已經制成結晶或得到高度純化物的蛋白酶商品達100 多種[11]。與動物源和植物源蛋白酶相比，微生物產蛋白酶的提取工藝相對簡單，且不受脂肪干擾，發酵液經過離心去除菌體細胞后，即得粗酶液[58]。粗酶液的進一步純化常采用沉淀法、膜超濾法和色譜法等[59?61]。

微生物產蛋白酶與動植物蛋白酶同功不同源，其生產方式及理化性質的差異，決定其提取純化的方法不盡相同。每種純化方法都有其自身的優缺點，因此，通常采用多種純化方法串聯使用來達到最佳的純化效果[62]。Huang 等[63]從亨氏曲霉HX08 中分離出的酸性蛋白酶AP3 時，粗酶液經硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B 離子交換層析和Sephacryl S-200 凝膠層析三步純化，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定其分子量為33 kDa。Ghorbel 等[64]先后采用膜超濾、熱變性沉淀、Sephacryl S-200 凝膠層析、DEAE-纖維素離子交換層析的方法將蠟樣芽孢桿菌BG-1產生的鈣依賴性蛋白酶純化至均一，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測在34 kDa 處存在單一條帶。

傳統的蛋白酶分離純化方法仍存在許多問題，如結合效率不高、操作耗時、設備昂貴等。隨著分離技術的不斷發展，許多新方法應用于微生物蛋白酶的分離純化。Benmrad 等[65]應用FPLC 離子交換色譜和HPLC-ZORBAX PSM 300 HPSEC 凝膠過濾色譜對平菇來源的耐熱蛋白酶進行了純化。Rathnasamy等[66]報道了用天然深共晶溶劑（NADES）從蠟樣芽孢桿菌中提取純化纖溶蛋白酶的研究。該方法提取蛋白酶達到190 U/mL，再經陰離子交換柱純化后，酶活為2607.8 U/mL。Ortiz-Hernandez 等[67]開發了一種快速和準確的熒光分析方法來分析連接到纖維素膜和瓊脂糖凝膠上的酰胺基，該方法包括酰胺基與乙二醛和芳香醛的反應，形成熒光團，可通過熒光光譜和成像進行分析和定量。這些功能化多孔基質在絲氨酸蛋白酶的純化中有著重要的應用。Siqueira等[68]在聚乙二醇/磷酸鹽雙水相體系中，采用不連續和連續工藝提取溜曲霉URM4634 產生的蛋白酶。在最佳操作條件下，連續萃取和非連續萃取分離效率分別達到95.3%和90.0%。

微生物蛋白酶的分離純化方法多種多樣，其成本也有巨大差異，既可以應用色譜-質譜連用等大型設備進行分離獲得高純度蛋白酶用于科學研究，也可以用簡單的硫酸銨沉淀和層析進行粗分離應用于食品、飼料等行業。因此，要根據具體應用來選擇相應純度的蛋白酶。

5 微生物產蛋白酶在食品行業的應用

隨著生活水平的提高，人們對食品風味、口感和營養等方面的要求越來越高，蛋白酶是食品工業中最重要的一類酶，對提高食品品質、安全和營養具有重要作用[69]。在食品加工過程中，往往需要具有特殊功能或是活性的蛋白酶，而微生物是特殊用途蛋白酶的重要來源，因此，微生物產蛋白酶在食品行業中具有廣泛的應用前景。

5.1 在肉類加工中的應用

嫩度是評價肉制品品質的重要指標，經蛋白酶處理能夠起到肉質嫩化的作用[70]。米曲霉產生的酸性蛋白酶能夠有效降解肌肉中的肌原纖維蛋白和膠原蛋白，在肉類加工中起到改善肉質，增加肉類嫩度的作用[71]。He 等[72]將深海冷適應菌Pseudoaltermonas sp.SM9913 產生的低溫蛋白酶和Bacillus sp.SM98011產生的中溫蛋白酶分別噴灑在海魚、豬肉和蝦仁表面，結果表明，經低溫蛋白酶處理的冷凍肉樣品，比經中溫蛋白酶處理的樣品釋放出更多的味覺氨基酸和必需氨基酸。因此，低溫蛋白酶在改善冷藏肉的風味方面具有潛力，而微生物是低溫、耐熱和耐鹽蛋白酶的重要來源。

5.2 在保健食品中的應用

微生物產蛋白酶本身具有抗血栓、抗腫瘤、抗感染等作用，在功能性成分提取的過程中也發揮重要作用，因此，微生物產蛋白酶在保健食品行業具有廣泛的應用前景[69]。Cheng 等[73]從海洋芽孢桿菌中分離得到一種鈣依賴的堿性蛋白酶，具有高纖溶活性，可用于抗血栓保健食品的研發。納豆激酶是由枯草芽孢桿菌產生一種絲氨酸蛋白酶，由于其具有良好的抗血栓活性而備受關注。Thu 等[74]從蝦殼中分離獲得的一株枯草芽孢桿菌C10 菌株，其產生的納豆激酶纖溶活性高達400 U/mg 左右，在保健食品行業極具商業價值。姜光域[75]從沙蟬消化道分離出一株微生物，其產生的胞外蛋白酶D2 對鼠乳癌細胞EMT6增殖具有明顯抑制作用，顯示出一定抗腫瘤活性。Ghanshyam 等[76]從印度西海岸分離出一株能夠產生胞外有機溶劑穩定的蛋白酶產生菌，該胞外蛋白酶具有促進傷口收縮愈合的作用。近年來，保健食品行業快速發展，功能性多肽和多糖產品備受關注，由于海洋特殊的生活環境，導致海洋生物體內物質的合成過程與陸生生物不同，并產生許多結構新穎、作用特殊的活性多肽和多糖，蛋白酶在多肽的制備及多糖的提取起到了關鍵的作用。Miao 等[77]采用復合蛋白酶酶解牡蠣肉制備的牡蠣多肽，具有抗氧化和抗疲勞活性，在保健和治療慢性病方面有很好的應用前景。Chen 等[78]采用中性蛋白酶酶解法制得的貽貝多糖，具有良好的抗氧化活性，可作為保健食品中的天然抗氧化劑。

5.3 在其他食品加工過程中的應用

在干酪的制作過程中加入枯草芽孢桿菌產生的堿性蛋白酶能夠水解κ-酪蛋白，代替凝乳酶完成干酪加工，解決凝乳酶短缺這一限制干酪加工發展的難題[79]。在一些調味品發酵過程中，米曲霉產生的耐鹽蛋白酶能夠有效降解蛋白質，減少苦味肽的產生，促進風味物質的形成[11]。在釀酒工業中，蛋白酶常用于去除啤酒中的蛋白質，一般在巴氏消毒前加入蛋白酶，以減少啤酒混濁現象的發生，因此，嗜熱微生物中的蛋白酶可應用于啤酒的澄清[80?81]。研究人員在不斷開發具有特殊功能的微生物產蛋白酶，如低溫蛋白酶、耐熱蛋白酶、高穩定性蛋白酶和廣泛底物范圍蛋白酶等，用以開發新型食品、改良食品品質和改進食品加工工藝。隨著研究的深入，微生物產蛋白酶將會在食品行業中發揮更大的作用。

6 存在問題及展望

目前國際上商品化的微生物產蛋白酶多達100多種，但是仍然存在微生物產蛋白酶資源開發不足的問題，采用宏基因組技術在環境中分離篩選高效蛋白酶或是新型蛋白酶，如低溫蛋白酶、耐熱蛋白酶等，以滿足各行各業的特殊需求，豐富微生物產蛋白酶種類，是未來研究的一個發展趨勢。隨著分子生物學技術手段的發展，我國微生物產蛋白酶的研究也已從酶的結構和性質研究，深入得到利用蛋白質工程選育高產菌株和改善酶的性質。隨著研究的進一步深入，微生物產蛋白酶必將在實際應用中發揮更大的作用。