苦丁皂苷D的分離純化及其納米粒的制備表征

胡夏恬，張鳳清, ，于 敏

（1.長春工業大學化學與生命科學學院，吉林長春 130012；2.吉林省中醫藥科學院，吉林長春 130118）

苦丁茶冬青（Ilex kudingchaC.J.Tseng）為冬青科冬青屬喬木植物，是藥、飲兼用之名貴珍品[1?2]，富含五環三萜及皂苷類、黃酮、甾體、多糖等多種化學成分[3?4]，具有降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗氧化等多種生物學活性[5?10]?？喽≡碥誅（Kudinoside D）是從苦丁茶冬青中提取的三萜皂苷類化合物[11?12]，研究表明Kudinoside D 能抑制膽固醇腸道吸收，顯著降低血漿中總膽固醇、總甘油三酯且升高血漿高密度脂蛋白的水平，此外還有降低甘油三酯、抗氧化、腎保護和改善血液流變學等作用，可以用于治療高血脂及其相關疾病，具有良好的制藥用途[13]。

雖然Kudinoside D 有良好的保健作用，但Kudinoside D 水溶性差，生物利用度低，這是導致其藥效作用發揮不佳的重要因素。隨著納米技術的發展，納米藥物載體在提高難溶性藥物溶解度方面的作用日益凸現[14?19]。聚谷氨酸（γ-PGA）具有無毒性、生物相容性高等優點[20?21]，L-苯丙氨酸乙酯（L-PAE）可作為疏水基團與γ-PGA 形成良好的兩親性納米載藥系統[22?24]。兩親性聚合物γ-PGA-PAE的親脂端可以包裹脂溶性藥物，同時其親水性可以使被包裹的藥物形成良好的水化層，使藥物水溶性和穩定性更高[25]。然而目前納米制劑的研究多為化學藥物納米制劑，對植物提取物納米制劑的研究較少，與此同時大多數納米粒的相關研究普遍只從納米粒的制備方面著手，少有篩選載藥納米粒制備方法的研究報道。

為了提高Kudinoside D的生物利用度，本研究分別采用沉淀法、透析法制備Kudinoside D 納米粒，并對其理化性質進行表征，為開發保健功能效果更好的Kudinoside D 新型制劑提供一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦丁茶冬青 海南省產；聚谷氨酸（γ-PGA） 海寧市紫金港生物科技有限公司；硅膠100～200 目青島海洋化工有限公司；L-苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽（LPAE） 上海麥克林生化科技有限公司；碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC.I） 美國阿拉丁工業公司；二甲基亞砜（DMSO）、氘代二甲基亞砜 北京鼎國昌盛生物技術有限公司；氯化鈉、二氯甲烷、鹽酸 北京化學試劑公司；乙腈、甲醇 色譜純，美國Fisher 公司；透析袋 北京索萊寶科技有限公司；超純水 實驗室自制；其他試劑均為分析純。

LC-20A 型高效液相色譜儀 日本島津公司；FW10C 高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；HH-6 數顯恒溫水浴鍋 常州中捷實驗儀器制造有限公司；PHS-3E 型pH 計 上海儀電科學儀器股份有限公司；Millipor-Q 型超純水機 美國Millipor 公司；LKTC-E 恒溫振蕩器 金壇市城東新瑞儀器廠；Hwcb-2 恒溫磁力攪拌器 溫州市醫療電器場；5424R 高速冷凍離心機 德國Eppendorf 公司；FD-1D-50 真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；AV600 一維及二維核磁共振譜 美國Bruker 公司；HT7820 透射電鏡 日本日立公司；動態納米粒度儀 英國Malvem Instruments 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Kudinoside D的分離純化及鑒定 參考文獻[26]方法，稱取7.5 kg 干燥的苦丁茶冬青葉粉碎，用8 BV 70%乙醇浸提3 次，每次5 d，合并提取液減壓濃縮（40 ℃）至無醇味，制得浸膏。分別用3 L×4 L的石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇依次萃?。簩⒘黧w狀浸膏轉入分液漏斗中，先加入4 L 萃取劑充分振搖，靜置分層，收集有機溶劑部分，共萃取3 次，合并萃取液；再在流體狀浸膏中加入下一萃取劑用同樣方法重復萃取3 次。將各萃取部位減壓濃縮、低溫蒸干（40 ℃）后，固體粉碎過100 目篩。取正丁醇萃取部位粉末100 g，經正向硅膠柱層析，二氯甲烷-甲醇（4:1）50 倍體積洗脫，收集洗脫部分，再經ODS 填料甲醇-水（8:1）50 倍體積洗脫，半制備型高效液相純化，得到化合物I-9 162 mg。

色譜條件：選用YMC-Pack C18柱，流動相乙腈（A）-水（B）二元梯度洗脫，0～15 min 30% A，15～45 min 30%～50% A，分析時間45 min，流速2.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長254 nm，進樣量40 μL。

鑒定：稱取5 mg 化合物I-9 用0.5 mL 氘代吡啶溶解，轉移至核磁管中，進行核磁檢測（1H-NMR、13CNMR）。1H-NMR 測定條件：測定溫度298 K，頻率600 MHz，譜寬33333 Hz；13C-NMR 測定條件：測定溫度298 K，頻率150 MHz，譜寬33333 Hz。

1.2.2 聚谷氨酸與L-苯丙氨酸乙酯共聚物（γ-PGAPAE）的合成 參考文獻[27]方法，稱取1.01 gγ-PGA，加入超純水50 mL,在恒溫振蕩器中振搖5～6 h（37 ℃，200 r/min）充分溶解。調節γ-PGA 溶液的pH 至3.0（1 mol/L HCL 溶液），置于98 ℃恒溫水浴中，降解9 min，立即冰浴冷卻，再將溶液的pH 調至7.0（1 mol/L NaOH 溶液），結束降解反應，得到小分子γ-PGA 溶液。

稱取EDC.I 2.61 g 加入上述小分子γ-PGA 溶液中，于恒溫振蕩器中振搖15 min（37 ℃，200 r/min），再加入L-PAE 1.06 g，于恒溫振蕩機中反應24 h（37 ℃，200 r/min）。反應產生白色沉淀，用超純水洗滌（離心14000 r/min，10 min），棄上清，重復3 次，將沉淀物質真空冷凍干燥48 h，得到產物γ-PGA-PAE 1.24 g。

1.2.3γ-PGA-PAE的純化與鑒定 將1.2.2 中得到的γ-PGA-PAE 材料溶解于5 mL的DMSO 溶液中，再將該溶液用滴管滴加于5 mL 超純水中，滴加后得到乳白色半透明溶液，離心（14000 r/min，10 min）后棄去上清，清洗過程重復三次。將沉淀真空冷凍干燥24 h 以上，得到已純化的γ-PGA-PAE 材料。取500～600 μL 氘代DMSO 加入到純化后的γ-PGAPAE 材料（6～8 mg）中，于恒溫震搖器中振蕩24 h 以充分溶解（37 ℃，120 r/min）。將樣品溶液轉移至核磁管中，進行核磁檢測（1H-NMR）。

1.2.4 Kudinoside D 納米粒的制備 稱取5 mg Kudinoside D 和20 mgγ-PGA-PAE，溶解于2 mL DMSO 中，將混合溶液用滴管緩慢滴加于2 mL 超純水中，磁力攪拌3～4 h（120 r/min），制成納米粒溶液，同樣方法另制備一份納米粒溶液。將一份納米粒溶液在高速冷凍離心機中離心10 min（14000 r/min），棄上清，收集底部沉淀；另一份納米粒溶液，轉移至透析袋（截留相對分子質量1500）中并用循環水透析24 h，收集底部沉淀。將收集的兩份物質真空冷凍干燥24 h 后分別得Kudinoside D 納米粒15.08 mg、24.62 mg。比較兩種方法制得納米粒的包封率與載藥量，擇優進行表征及體外釋藥特性的考察。

1.2.5 包封率、載藥量測定 HPLC 色譜條件：Angilent Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相乙腈-水（4:6），流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長為254 nm。此色譜條件下對Kudinoside D 對照品進行線性關系考察。精密稱取Kudinoside D 10 mg于100 mL 容量瓶中，加入甲醇定容得濃度為100 μg/mL的藥物溶液。取適量溶液配制成1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0、15.0 μg/mL的溶液，進樣20 μL，以峰面積（Y）與質量濃度（X）進行線性回歸。

稱取Kudinoside D 納米粒5 mg 加入1 mL 丙酮，超聲10 min 溶解，用旋轉蒸發儀（40 ℃）去除有機相，再加入2 mL 甲醇超聲5 min，經0.45 μm的微孔濾膜過濾后得到供試品溶液。HPLC 法檢測包封率和載藥量，HPLC 色譜條件同上。

包封率EE（%）=（W1/W2）×100

載藥量DL（%）=（W1/W3）×100

式中：W1為載藥納米粒中藥物的質量，mg；W2為總投藥量，mg；W3為載藥納米?？傎|量，mg。

1.2.6 Kudinoside D 納米粒的表征 取適量Kudinoside D 納米粒用超純水重懸，通過動態納米粒度儀檢測納米粒尺寸、粒徑分布及Zeta 電位。將Kudinoside D 納米粒重懸樣品滴加到銅網上，烘干，用1%的鉬酸銨溶液染色后，通過透射電鏡檢測Kudinoside D 納米粒的形態和尺寸。

1.2.7 Kudinoside D 納米粒的體外釋藥特性考察稱取Kudinoside D 納米粒5 mg，加入適量0.1 mol/L的PBS（pH7.4）超聲分散，轉移至透析袋中（截留相對分子質量1500），將透析袋扎緊后置于含有50 mL PBS的燒杯中，于恒溫振蕩器中振蕩48 h（37 ℃，100 r/min），定時取樣2 mL，同時補加同等體積0.1 mol/L的PBS（pH7.4）。用HPLC 外標法檢測Kudinoside D的含量，色譜條件同1.2.5，并計算釋藥量。

釋藥量DR（%）=（W4/W1）×100

式中：W4為透析后釋放的藥物質量，mg；W1為載藥納米粒中藥物的質量，mg。

1.3 數據處理

本文所用數據為2 次平行實驗結果均值；繪圖軟件采用ChemDraw。

2 結果與分析

2.1 Kudinoside D的結構鑒定

1.2.1 中制得的化合物為白色粉末I-9。HPLC檢測結果顯示化合物的色譜峰保留時間與Kudinoside D 一 致，為6.29 min；1H-NMR（600 MHz，Pyridine-d5）譜鑒定結果顯示，δ0.85、0.90、1.07、1.24、1.41、1.55、1.71（各3H，s）為五環三萜母核上7 個甲基質子信號，δ3.32（dd，J=11.7 4.4 Hz）為C-3 上連氧次甲基質子信號，5.79（dd，J=10.6，1.9 Hz）和7.53（dd，J=10.5，3.1 Hz）為一對順式雙取代的烯質子信號，δ4.90（d，J=5.7 Hz，1H）、5.14（d，J=7.8 Hz，1H）、6.20（s，1H）分別為三個糖（Ara、Rha、Glc）端基碳質子信號；13C-NMR（600 MHz，Pyridine-d5）譜圖中共顯示47 個碳信號，其中δc175.34 為C-28 羰基信號，δc127.31、128.55 和140.85、135.12 分別為C-11 和C-12 位及C-13 與C-18 形成的共軛雙鍵碳信號，δc104.99（3-Ara-1）、δc104.92（Glc-1）、δc102.11（Rha-1）分別為三個糖基的端基碳信號。該化合物的核磁數據與文獻[28]中Kudinoside D的報道吻合，故確認化合物為 Kudinoside D?；衔镆合嗌V譜圖如圖1，核磁結果如圖2、圖3，分子結構式如圖4。

圖1 化合物I-9 與Kudinoside D 液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of compound I-9 and Kudinoside D

圖2 Kudinoside D 1H-NMR 圖譜Fig.2 1H-NMR spectra of Kudinoside D

圖3 Kudinoside D 13C-NMR 圖譜Fig.3 13C-NMR NMR spectra of Kudinoside D

圖4 Kudinoside D 分子結構圖Fig.4 The molecular structure of Kudinoside D

2.2 γ-PGA-PAE的鑒定

為改善高分子材料γ-PGA 水溶液黏度過高不利于L-PAE 進行修飾反應的問題，本文采取了高溫酸解法，將分子量較大的γ-PGA 降解，再加入EDC.I 進行縮合反應，從而使γ-PGA 側鏈的羧基和L-PAE 上的氨基都脫去一分子的H2O，形成肽鍵后在γ-PGA的側鏈上成功連接L-PAE，形成兩親性聚合物γ-PGA-PAE[27,29?30]。1H-NMR 結果顯示（圖5），圖譜中標注的a、b、c、d 處符合γ-PGA的特征峰（δ值分別為7.89、4.27、1.85、2.13 ppm），圖上標注的e、f、g、h、i 和j 處符合L-PAE的特征峰（δ值分別為8.34、4.43、3.99、1.07、3.00、7.18 ppm），與文獻[22]一致,說明L-PAE 與γ-PGA 已成功連接組裝為兩親性的γ-PGA-PAE 材料。

2.3 Kudinoside D的納米粒包封率和載藥量

經HPLC 檢測，回歸方程為Y=3963.8X?7.875（R2=0.9997），在1.0～15 μg/mL 范圍內線性關系良好，可用于藥物含量的測定和體外溶解度實驗分析。沉淀法制備的納米粒包封率為44.14%，載藥量為2.99%；透析法制備的納米粒包封率為65.46%，載藥量為13.24%。故選用透析法制備的納米粒進行表征和體外緩釋效果的考察。

2.4 Kudinoside D 納米粒的形態表征

本研究制備的Kudinoside D 納米粒凍干粉末呈白色，溶液為乳白色透明液體。透射電鏡結果顯示（圖6），Kudinoside D 納米粒呈現規整的圓球形，大小較均一，分布均勻，無明顯的團聚現象，根據粒徑分布圖可判斷（圖7），Kudinoside D 納米粒平均半徑為（75±25）nm，分散系數為0.18，Zeta 電勢為33.7，表明所得納米粒大小理想，分布較集中，帶有較強正電荷，穩定性較好。

圖6 Kudinoside D 納米粒的透射電鏡圖Fig.6 The TEM imge of Kudinoside D nanoparticles

圖7 Kudinoside D 納米粒的粒徑分布圖Fig.7 Particle size distribution of Kudinoside D nanoparticles

2.5 Kudinoside D 納米粒的體外緩釋效果考察

由圖8 可知，與Kudinoside D 納米粒相比，游離Kudinoside D 在3 h 時就已釋放了50%，在10 h時已經完全釋放，而Kudinoside D 納米粒較游離Kudinoside D 無明顯突釋現象，藥物在10 h 時才釋放到達50%，之后釋放趨于平緩。體外緩釋實驗表明Kudinoside D的納米粒具有緩釋特點，這說明Kudinoside D 納米粒能增加血藥濃度作用的時間。

圖8 Kudinoside D 納米粒的緩釋曲線Fig.8 Sustained release curve of Kudinoside D nanoparticles

3 結論

本研究以γ-PGA-PAE 為載體，采用沉淀法和透析法制備Kudinoside D 納米粒，結果顯示透析法制備納米粒的包封率為65.46%，載藥量為13.24%；沉淀法制備納米粒的包封率為44.14%，為載藥量2.99%，說明所得納米粒包封率較高，載體對藥物有很好的相容性。高包裹率的納米粒能顯著提高Kudinoside D的穩定性，故對包封率和載藥量更高的透析法制備的Kudinoside D 納米粒進行表征和體外緩釋效果考察。結果顯示所得Kudinoside D 納米粒粒徑均一，平均粒徑為（75±25）nm，分散度良好，同時Kudinoside D 納米粒與單純Kudinoside D 藥物相比具備了更好的緩釋效果。Kudinoside D 納米粒的緩釋特性能使血藥濃度維持平穩，可避免藥物的快速降解，減少給藥次數，增加藥物作用時間。此外，Kudinoside D 納米粒具有良好的納米尺寸，對其進行修飾可制備腦內藥物遞送系統。本研究對Kudinoside D 納米粒進行了體外表征，其體外生物活性還需要進一步驗證。雖然納米藥物制劑發展前景廣闊，但目前大多處于實驗室研究的階段，尤其是靶向納米藥物制劑，體內生物實驗經驗積累更少。制備納米藥物制劑過程中使用的輔料的毒性問題及載藥納米粒進入機體后是否會沉積等問題仍需研究。再者，目前納米藥物制劑的制備主要是在實驗室制備，同時對所生產的納米藥物制劑尚未有完善的質量標準評價體系，對其進行質量的把控?？偠灾?，納米藥物制劑在藥物制劑乃至臨床醫藥領域都有很高的研究價值，值得深入探究。