液相質譜聯用法同時測定復方甘草片中甘草酸和嗎啡

李冬云，韋夢秋

（1. 玉林市食品藥品檢驗檢測中心，廣西 玉林 537000；2. 右江民族醫學院，廣西 百色 533000）

復方甘草片是臨床上常用的祛痰鎮咳復方制劑，由甘草浸膏粉、阿片粉或罌粟果提取物粉、樟腦、八角茴香油與苯甲酸鈉制成[1-3]。復方甘草片作為基本藥物，收錄于《中國藥典》2020年版二部，方法中分別對嗎啡和甘草酸進行含量測定，均使用液相色譜儀，因基質復雜的緣故，嗎啡的含量測定方法中需用固相萃取法（SPE）進行前處理，洗脫過程復雜耗時，可能導致洗脫不完全；甘草酸含量測定方法操作較簡便，但常出現甘草酸峰與其他成分峰難以分離的情況[4-5]。本文建立了液相質譜聯用法同時測定復方甘草片中嗎啡和甘草酸的含量，此法前處理簡便，準確，快速，能有效用于該藥品的質量控制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 液相質譜聯用儀（型號：Xevo-TQSmicro，美國沃特世公司），十萬分之一電子分析天平（型號：XS-205DU，上海梅特勒-托利多儀器有限公司）,數控超聲波清洗器（型號：KQ-250DB，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.1.2 試劑 復方甘草片（桂林南藥股份有限公司，批號CG190714；國藥集團工業有限公司，批號：20190724，20191220）；甘草酸銨對照品（批號：RJ171229-15，Stanford Chemicals公司）；嗎啡對照品（批號：171201-200822，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈（色譜純，德國默克公司）；超純水由Millipore超純水儀制備。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 Agilent Zorbax Hilic Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈-15 mmol/L乙酸銨（50:50，v/v），流速0.25 ml/min，柱溫40 ℃，進樣量 5 μl。

1.2.2 質譜條件 ESI+，毛細管電壓4.0 kV，霧化器壓力35 psi，干燥器溫度300 ℃，干燥器流速12 L/min，化合物質譜詳細條件見表1。

表1 目標化合物質譜參數

1.2.3 溶液的配制

1.2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取甘草酸對照品48.75 mg、嗎啡對照品11.08 mg分別置入50 ml量瓶，加甲醇，搖勻，作為各自的單標儲備溶液，精密量取甘草酸儲備液5 ml、嗎啡儲備液1.25 ml置入同一25 ml量瓶，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得每1 ml含有甘草酸191 μg、嗎啡11.08 μg/ml的混合對照品溶液。

1.2.3.2 供試品溶液的制備 取批次為CG190714的復方甘草片20片，稱重，研細，稱取相當于1片的量置于100 ml量瓶，加甲醇-水（1:1）適量，超聲提取處理（300 W，250 kHz）20 min，取出冷卻，用甲醇-水（1:1）定容至刻度，搖勻，過濾，精密量取1 ml置于20 ml量瓶，用甲醇-水（1:1）稀釋至刻度，搖勻后用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液。

1.2.3.3 陰性樣品溶液制備 取不含甘草酸和嗎啡的陰性樣品，同法制備陰性樣品溶液，無干擾。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 專屬性試驗 取混合對照品溶液、陰性樣品溶液進樣分析，對照品溶液中的嗎啡與甘草酸MRM圖譜及陰性樣品的MRM圖譜見圖1。

圖1 嗎啡與甘草酸MRM圖譜

2.1.2 線性與范圍 吸取“1.2.3.1”項中的混合對照品溶液0.10，0.20，0.40，0.80，1.00 ml置入10 ml量瓶，然后加甲醇稀釋至刻度，經0.22 μm濾膜過濾，依照“1.2”項下的色譜和質譜條件進樣5 μl，以咖啡與甘草酸的響應值Y為縱坐標，以含量（X，μg/ml）為橫坐標，得回歸方程如下

表2 線性方程、相關系數、線性范圍

2.1.3 精密度試驗 精密吸取線性中混合對照品溶液的第3個濃度點，重復進樣6次，分別測得甘草酸峰響應值為 58 443，57 652，57 886，58 412，58 069，58 613，RSD為0.64 %；嗎啡響應值為9424，9376，9298，9412，9408，9351，RSD為0.51 %，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩定性試驗 精密稱取供試品（批號：CG190714），按“1.2.3.2”項方法制備1份供試品溶液，按照選定的色譜、質譜條件分別在供試品溶液制備后0、4，8，12，16，20和24 h進樣5 μl，測得甘草酸響應值為：48 052，47 599，47 682，47 623，47 084，47 312，47 146，RSD為0.72 %；測得嗎啡響應值為：4562，4531，4539，4567，4550，4512，4518，RSD為0.46 %，結果表明，試驗溶液在24 h內穩定。

2.1.5 重復性試驗 精密稱取供試品（批號：CG190714）的樣品6份，按“1.2.3.2”項方法制備6份供試品溶液，按照選定的色譜、質譜條件測得甘草酸含量為10.757，10.756，10.593，10.601，10.787，10,848 mg/片，RSD為0.97 %；嗎啡含量為0.363，0.370，0.374，0.364，0.368，0.360 mg/片，RSD為1.4 %，表明分析方法重復性良好。

2.1.6 加樣回收試驗 精密稱取供試品（批號：CG190714）的樣品6份，精密加入甘草酸單標儲備液4 ml、嗎啡單標儲備液1 ml，按照“1.2.3.2”項方法制備6份供試品溶液，按照選定的色譜、質譜條件測定，甘草酸回收率為：95.9 %，98.0 %，97.7 %，93.5 %，95.6 %，98.1 %，平均值為96.5 %，RSD為1.86 %；嗎啡回收率為：105.6 %，106.5 %，104.7 %，107.4 %，103.8 %，102.0 %，平均值為105.0 %，RSD為1.90 %。

2.2 樣品含量測定

分別取不同廠家、批次復方甘草片20片，按照1.2.3項下的方法制備，按照選定的條件進樣，樣品含量見表3。

3 討論

3.1 2020年版《中國藥典》利用嗎啡的酸堿兩性，先加入稀鹽酸使其成酸性，然后再利用氨水堿化，使嗎啡能在固相萃取小柱保留，最后利用酸化的甲醇洗脫收集，操作步驟復雜。本方法用甲醇直接超聲提取，無轉移過程，簡化了前處理步驟也降低了處理成本。

3.2 通過對嗎啡對照品前體離子掃描得到嗎啡加合離子[M+H+][6-7]，m/z 286.3，在不同碰撞能量下均產生m/z 165.0和m/z 181.1。經過工作站MS條件優化處理，在碰撞能量20 V時，兩個子離子的離子相對豐度最高，且m/z 165.0高于m/z 181.1，故確定m/z 286.3/165.0為定量離子對，m/z 286.3/181.1為定性離子對。同法操作，甘草酸銨對照品在同樣掃描處理過程中產生的定量離子對為m/z 823.9/453.5，定性離子對為m/z 823.9/189.0[8-9]。

3.3 由于嗎啡在樣品中含量低，標準規定為0.36～0.44 mg/片，且紫外檢測容易受其他成分干擾，所以樣品前處理需要固相萃取，增加了前處理步驟的復雜性和可操作性難度。液相色譜電噴霧三重四級桿質樸靈敏度高、選擇性高和多離子檢測模式（MRM）定量準確[10-11]，因此，利用現有先進設備建立更簡便、高效、準確的檢測方法對藥品生產企業提高質量控制能力和藥品檢驗檢測機構提高效率方面意義重大。

4 結論

本文采用液相質譜聯用法同時測定復方甘草片中的甘草與嗎啡含量，前處理簡單，精密度、重現性、穩定性好，結果準確，為復方甘草片及含甘草、嗎啡的藥物制劑等質量控制提供依據和參考。