蠟樣芽胞桿菌BC307的分離鑒定及其RsiP蛋白的抗體制備

鄭慶芳，劉麗娜，劉先凱，呂宇飛，王恒樑，王東澍*，邱澤武

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(軍事科學院軍事醫學研究院生物工程研究所 病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京，100071) 3(興安盟人民醫院，內蒙古 烏蘭浩特，137400) 4(解放軍總醫院第五醫學中心(南院區)中毒救治科，北京，100071)

蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)是蠟樣芽胞桿菌族(Bacilluscereussensu lato)的重要成員之一，是一種常見的食源性致病菌，廣泛存在于水、空氣、土壤和食品中，在長時間室溫放置的米飯等淀粉類食品中經常被發現[1]。部分高毒力菌株產嘔吐毒素，能導致爆發性，甚至致死性的食物中毒事件[2]。嘔吐毒素是一種小分子縮合肽，它對酸、堿、熱穩定，在一般的食品加工中不易被破壞，且其活性不受胃蛋白酶的干擾，所以在活菌被消除的情況下仍能引起食物中毒[3]。

蠟樣芽胞桿菌大多具有青霉素耐藥性。β-內酰胺類抗生素的靶標是細菌的細胞壁，通過抑制青霉素結合蛋白(penicillin-binding proteins，PBPs)的轉肽酶活性減少肽聚糖的生物合成，使細胞膜受到損傷，隨后細菌裂解死亡[4]。當外界環境發生變化時，為了維持正常的生命活動，許多細菌利用σ因子，如胞外功能(extracytoplasmic function，ECF)σ因子來響應細胞壁損傷，這些因子都是在特定條件下經誘導被激活后發揮作用[5]。σP(SigP)就是一個在蠟樣芽胞桿菌族成員中發現的ECF σ因子[6]。β-內酰胺酶的表達受到了SigP的調控，而SigP的激活則依賴于抗SigP因子RsiP的降解[7]，因此RsiP是調控蠟樣芽胞桿菌青霉素耐藥性的重要因子。

本研究從解放軍總醫院第五醫學中心食物中毒病人的食物殘渣中分離出1株含有高嘔吐毒素毒力的蠟樣芽胞桿菌，命名為BC307。BC307具有青霉素抗性，對RsiP進行分析，將RsiP蛋白進行原核表達并純化，制備多克隆抗體，驗證蠟樣芽胞桿菌中RsiP蛋白的表達，為蠟樣芽胞桿菌耐藥性的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

蠟樣芽胞桿菌BC307(中國醫學細菌保藏管理中心，編號CMCC(B)63317)；蠟樣芽胞桿菌HN001(腹瀉型食物中毒分離株)；炭疽芽胞桿菌疫苗株A16R；蘇云金芽胞桿菌BT9727；感受態細胞BL21(DE3)，北京全式金生物技術有限公司。

1.2 實驗動物

無特定病原(specified pathogen free, SPF)級，BALB/c小鼠，5周齡，雌性，北京維通利華實驗動物有限公司。

1.3 實驗試劑

二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride， PMSF)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、NaCl、甘油、咪唑、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside， IPTG)、硫酸卡那霉素、Trition X-100，生工生物工程(上海)股份有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；Ni-IDA瓊脂糖凝膠、SDS-PAGE上樣緩沖液、SDS-PAGE電泳緩沖液、SDS-PAGE預制膠、SDS-PAGE Marker，南京銘研生物科技有限公司；HRP-羊抗鼠IgG(H+L)、免疫佐劑QuickAntibody-Mouse3 W，北京康為世紀生物科技有限公司。

1.4 BC307菌株的分離和初步鑒定

稱取50 g病人的食物殘渣，加生理鹽水至110 g。充分勻漿混勻后，吸取1 mL懸濁液稀釋至10-5后吸取1 mL接種在LB瓊脂培養基上，用L型涂布棒涂布于整個表面，置于37 ℃恒溫箱培養10～13 h后進行計數，選取菌落做驗證實驗。

首先利用16S rDNA序列鑒定分離株的種屬[8]，再用gyrB序列[9]和炭疽芽胞桿菌毒力大質粒上特異性引物lef(位于pXO1)[10]和capC(位于pXO2)[11]進一步鑒定，以與炭疽芽胞桿菌區分。引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成，序列如表1。

挑取平板上的單克隆菌落進行革蘭氏染色并鏡檢。

利用蠟樣芽胞桿菌產生磷脂酶[12]和溶血素[13]的特性鑒定分離株，將LB固體平板上挑選的單克隆分別涂布在卵黃平板和綿羊血平板上，37 ℃培養10～13 h后，與炭疽芽胞桿菌疫苗株A16R(缺失pXO2)[14]進行比較，拍照記錄。

挑取BC307單克隆菌落接種于5 mL LB液體培養基，37 ℃、220 r/min振蕩培養13 h，取400 μL菌液涂布LB固體平板，待菌液吹干后按照說明書輕輕貼上氨芐西林Etest藥敏試紙條，在37 ℃培養箱中孵育，10 h后判讀試紙條。

由圖3可知，美麗兜蘭在光合有效輻射(PAR)達到786 μmol·m-2·s-1時的凈光合速率(Pn)達到最大。其中，以P1處理的美麗兜蘭凈光合速率(Pn)最大，達到6.47 μmol·m-2·s-1；P2、P3處理的美麗兜蘭的凈光合速率均高于CK處理的凈光合速率；隨著光照強度的進一步降低，P3處理的美麗兜蘭的光合速率進一步降低，最大光合速率僅為4.32 μmol·m-2·s-1，但仍比CK處理的最大光合速率提升了1.05倍。表明美麗兜蘭在遮蔭條件下利于光合作用的進行，提高了美麗兜蘭的光合利用效率，但也不宜過度遮蔭。

1.5 管家基因和毒力基因的鑒定

通過PCR擴增蠟樣芽胞桿菌族菌株BC307的管家基因(glp、gmk、ilv、pta、pur、pyc、tpi)[14]并測序，對BC307與其他11株蠟樣芽胞桿菌族菌株(BC-AH187、BC-NC7401、BC-10987、BC-14579、BC-AH820、BC-E33L、BA-A2012、BA-Ames、BA-Ames Ancestor、BT-HD73、BT-9727)一起進行多位點序列分型分析(Multilocus Sequence Typing，MLST)，使用MEGA-X生成聚類樹圖[15]，在線編輯聚類樹圖使用(https://itol.embl.de/)。通過PCR擴增毒力基因ces基因簇[16]，引物信息如表1。

1.6 抗sigma因子RsiP的生物信息分析

蠟樣芽胞桿菌族成員中，炭疽芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌研究最為廣泛，它們的DNA序列具有極高的同源性[17]，但是蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌具有青霉素耐藥性而炭疽桿菌一般對青霉素敏感[18]。為探究RsiP對細菌青霉素耐藥性的影響，我們對蠟樣芽胞桿菌族成員炭疽芽胞桿菌Ames菌株、蠟樣芽胞桿菌BC307、蘇云金芽胞桿菌BT9727的RsiP氨基酸序列同源性進行BLAST分析。

SigP-bla1開放閱讀框和BLAST分析采用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線工具和DNAMAN軟件；蛋白質序列分析和分子量預測采用ExPASy在線Scan Prosite程序(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)。

1.7 蠟樣芽胞桿菌BC307 RsiP蛋白誘導表達及純化

重組表達載體pET28a-sumo-rsiP[19]由北京天一輝遠生物科技有限公司構建，將其轉化至BL21(DE3)感受態細胞中，構建表達菌株pET28a-rsiP-BL21。挑取pET28a-rsiP-BL21單克隆菌株于25 mL LB培養基(含有30 μg/mL Kan)中37 ℃振蕩培養、過夜活化，次日，按2%體積比轉接于1 L新鮮LB培養基(含有30 μg/mL Kan)中，37 ℃，200 r/min振蕩培養，至OD600為0.6時取1 mL菌液作為誘導前留樣；加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，20 ℃、200 r/min 誘導15 h。取1 mL菌液作為誘導后留樣，2管留樣12 000 r/min離心2 min收集菌體，棄上清液，加入100 μL 1×PBS振蕩重懸菌體，取20 μL加入5 μL 5×SDS凝膠電泳上樣緩沖液，混勻后100 ℃煮沸5 min，12 000 r/min 離心1 min，取其上清液進行SDS-PAGE電泳檢測。

將誘導后的菌液4 ℃，6 000 r/min離心20 min收集菌體沉淀，超聲裂解，以緩沖液[20 mmol/L Tris(pH 8.0)、300 mmol/L NaCl和20 mmol/L 咪唑溶于純水中]平衡Ni-IDA柱，最后用不同濃度咪唑的平衡緩沖液洗脫目標蛋白，并收集每個組分進行SDS-PAGE分析檢測。將收集的目的蛋白，用50倍體積的1×PBS透析過夜，加入sumo酶在4 ℃酶切12 h，然后過鎳柱收集流穿液，獲得RsiP重組蛋白。

1.8 RsiP抗體制備及血清效價測定

選擇5只雌性BALB/c小鼠，5周齡，按照每劑100 μL用量將抗原與佐劑1∶1混合，皮下多點注射，100 μL/只，14 d后加強免疫。第22天尾尖采血并分離血清，-20 ℃備用。采用ELISA法測定血清抗體滴度：用包被液將抗原稀釋至1 μg/mL，100 μL/孔加至酶標板，37 ℃孵育1 h；1× PBST洗板3次，加入封閉液，200 μL/孔，4 ℃過夜后棄封閉液；加入用PBS稀釋的待檢血清(起始稀釋度1∶10)，100 μL/孔，同時設陰性對照，37 ℃孵育1 h；1×PBST洗板3次，加入二抗(與TBST稀釋比例為1∶5 000)，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；1×PBST洗板3次，加入底物液，100 μL/孔，室溫放置5～8 min；加入終止液終止反應，50 μL/孔，酶標儀測定A450/A620，實驗孔與陰性對照孔的比值大于2.1且不小于0.2判定為陽性。最后進行血清采集、分離。

1.9 Western Blotting檢測蠟樣芽胞桿菌族成員RsiP蛋白的表達

制備炭疽芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌全菌蛋白樣品，將細菌培養至T3時期(生長曲線進入穩定期后的第3 h)，4 ℃、8 000 r/min離心8 min，收集50 mL菌體，用低鹽PBS重懸洗3次。用預先配好的5 mL裂解液(7 mol/L尿素與1% DTT溶于純水中)重懸菌體，分裝至硬壁管中，加入0.1 mm直徑的玻璃珠，在Precellys24均質器上6 500 r/min振蕩破碎菌體，每次20 s，冰上冷卻5 min，重復15次。20 ℃、1 200 r/min離心10 min，重復2次，收取上清液蛋白，盡量去除雜質和玻璃珠。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離和初步鑒定

取1 mL樣品，稀釋105倍后取1 mL涂板，培養10～13 h后，平板上的菌落數共計12 CFU。計算出食物中毒病人食物殘渣中活菌濃度為2.64×105CFU/g。BC307的16S rDNA PCR擴增結果如圖1-a，在1 500 bp處有明顯條帶，測序后經BLSAT比對后，與蠟樣芽胞桿菌NC7401、AH187等同源性達100%。利用PCR方法檢測蠟樣芽胞桿菌基因組上特異性引物gyrB，炭疽芽胞桿菌毒力大質粒上特異性引物lef(位于pXO1)和capC(位于pXO2)，發現該菌株可以擴增出gyrB基因特異性條帶，而lef和capC基因無條帶(圖1-b)；并且經過測序，BC307的gyrB序列與HN001相似度為100%，可初步認為此菌株為蠟樣芽胞桿菌。染色后顯微鏡下觀察，該菌為革蘭氏陽性菌，菌體為桿狀、末端方，呈短或長鏈，能產芽胞，芽胞圓形或柱形(圖1-c)，且沒有伴胞晶體，該菌株與蠟樣芽胞桿菌的形態表現一致。將LB肉湯固體平板上的BC307單克隆菌落分別涂布在卵黃平板和綿羊血平板上，培養10 h后，與炭疽芽胞桿菌A16R相比，BC307菌落出現了明顯的卵磷脂環(圖1-d)和溶血環(圖1-e)，符合蠟樣芽胞桿菌的特征。經10 h的培養，BC307在LB平板上長滿菌落，沒有在Etest試紙條周圍出現抑菌環(圖1-f)，對青霉素有非常強的抗性，與蠟樣芽胞桿菌耐藥特點相符。

綜上，通過菌落計數、16S rDNA鑒定、特異性基因PCR鑒定、菌株生理生化鑒定、藥敏試驗及顯微鏡下菌體形態鑒定發現，該食物中毒病例中分離的菌株可以擴增出蠟樣芽胞桿菌基因組特異性基因gyrB，存在卵磷脂環和溶血現象，具有青霉素耐藥性，菌體形態與蠟樣芽胞桿菌HN001相似，能夠正常形成芽胞，因此，初步確定該菌株為蠟樣芽胞桿菌并命名為BC307，該菌株目前已在中國醫學細菌保藏管理中心中心保藏，編號為CMCC(B)63317。

a、b-PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖，M-Marker，1-BC307， 2-HN001，3-A16R；c-分離菌的革蘭氏染色鏡檢圖；d-卵黃 平板和e-血平板，1～5代表分離株BC307的5個單克隆，平板中心 A16R為炭疽芽胞桿菌，作為陰性對照；f-Etest藥敏試驗圖1 分離株的鑒定Fig.1 Identification of isolates

2.2 菌株MLST分析和毒力基因的分析

我們進一步對BC307進行了MLST基因分型分析，根據管家基因的測序結果，使用在線工具https://pubmlst.org/organisms/bacillus-cereus進行比對，結果顯示BC307屬于ST26序列型。使用MEGA X軟件，與其他11株蠟樣芽胞桿菌群菌株一起構建UPGMA樹。進化距離使用最大合成似然法計算[20]，單位是每個位點的堿基取代數。該分析涉及12個核苷酸序列，對于每個序列對，刪除所有歧義位置(成對刪除選項)，進行了進化分析。BC307與其他ST26序列型成員，如NC7401等產嘔吐毒素的蠟樣芽胞桿菌，能在進化樹上聚類到一支，說明它們有高度的相似性(圖2-a)。

嘔吐毒素由非核糖體肽合成酶合成，編碼基因ces基因簇共24 kb，位于208 kb的大質粒上，包含cesA、cesB、cesC、cesD、cesH、cesP、cesT共7個編碼區[21]，如圖2-b所示。利用ces基因簇的引物PCR擴增BC307菌落，結果為陽性(圖2-c)，證明BC307基因組中存在ces基因簇，BC307為產嘔吐毒素的高毒力蠟樣芽胞桿菌菌株。

2.3 菌株青霉素抗性基因的分析

細菌對青霉素耐藥與β-內酰胺酶密切相關，β-內酰胺酶一般由bla基因編碼。在青霉素的誘導下[5]，蠟樣芽胞桿菌中的RsiP蛋白被多種蛋白酶降解，不再阻遏SigP的表達，SigP獲得自由后，調控自身與bla的轉錄，提高β-內酰胺酶的表達[7]，從而使細菌對氨芐青霉素耐藥，調控關系如圖3-a。

a-分離株的多位點序列分型；b-ces基因簇序列，共含有cesA、cesB、 cesC、cesD、cesH、cesP、cesT 7個編碼區；c-分離株毒素基因PCR產物 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，M- Marker，1～7分別代表ces 基因簇7個編碼區圖2 BC307毒力基因分析Fig.2 Virulence gene analysis of BC307

在NCBI網站在線對炭疽芽胞桿菌BA-Ames、蠟樣芽胞桿菌BC307、蘇云金芽胞桿菌BT9727的RsiP氨基酸序列進行了BLAST分析(圖3-b)。根據分析結果得知，炭疽芽胞桿菌的RsiP氨基酸序列與蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌相似性達98.07%。

a-炭疽芽胞桿菌Ames、蠟樣芽胞桿菌BC307和蘇云金芽胞桿菌 BT9727的sigP-bla1開放閱讀框；b-炭疽芽胞桿菌Ames、蠟樣芽胞桿 菌BC307和蘇云金芽胞桿菌BT9727 RsiP氨基酸序列的BLAST分析圖3 BC307青霉素抗性基因的分析Fig.3 Penicillin resistance gene analysis of BC307

2.4 外源蛋白的誘導表達

采用ExPASy在線Scan Prosite程序和Tmpred軟件分析蠟樣芽胞桿菌BC307 RsiP蛋白分子質量和跨膜情況，結果顯示RsiP蛋白分子質量約為32 kDa，在54～71位氨基酸處有一個跨膜結構域。為了優化蛋白外源表達和純化，構建表達載體時保留預測的RsiP蛋白膜內區域，預計重組蛋白分子質量約為25 kDa。將表達質粒轉化BL21(DE3)，誘導表達后得到蛋白大約40 kDa的目的條帶，與含標簽的目的蛋白預期大小一致；sumo酶切后得到25 kDa的條帶，與目的蛋白預期大小一致。經鎳柱親和純化成功獲得了高純度的RsiP重組蛋白，12% SDS-PAGE 檢測蛋白表達純化效果(圖4-a)。

2.5 ELISA檢測抗體效價

將RsiP蛋白免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體，采用ELISA法檢測血清IgG效價。將抗血清稀釋不同濃度(1∶10～1∶1 280)，實驗結果顯示佐劑對照組幾乎不產生RsiP抗體，實驗組RsiP蛋白的血清效價高達1∶1 280，RsiP蛋白能刺激小鼠產生較強的免疫應答，我們得到了高效價的RsiP多克隆鼠抗抗體(圖4-b)。

2.6 Western Blotting鑒定

將炭疽芽胞桿菌B17D2、蠟樣芽胞桿菌BC307和蘇云金芽胞桿菌BT9727的菌體蛋白作為抗原，RsiP抗血清作為一抗，通過Western Blotting進行鑒定。結果顯示小鼠血清中的抗體能與RsiP蛋白特異性結合。炭疽芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌胞內RsiP蛋白表達量無明顯差異(圖4-c，4-d)。

a-重組RsiP蛋白SDS-PAGE 分析，M-Marker, 1-RsiP蛋白，2-Sumo 標簽，3-含sumo標簽的RsiP蛋白；b-RsiP抗體效價；c-細菌中RsiP 蛋白的SDS-PAGE，d-抗體對細菌中RsiP蛋白的Western Blotting分析， M-Marker;1-炭疽芽胞桿菌A16R;2-蠟樣芽胞桿菌BC307; 3-蘇云金芽胞桿菌BT9727圖4 RsiP的表達純化及抗體制備Fig.4 Expression, purification and antibody preparation of RsiP

3 結論與討論

蠟樣芽胞桿菌引起的食物中毒對食品安全和人們的身體健康造成威脅。本研究在食物中毒病人食物殘渣中分離鑒定出一株產嘔吐毒素的蠟樣芽胞桿菌，命名為BC307，其具有很強的青霉素耐藥性。蠟樣芽胞桿菌群的成員非常相似，對蠟樣芽胞桿菌的鑒定首先要排除其是炭疽芽胞桿菌的可能性。16S rDNA鑒定不能有效地區分炭疽芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌。因此本研究在16S rDNA鑒定的基礎上，又通過特異性基因gyrB、lef、capC進行了驗證。通過溶血、卵磷脂酶等表型及青霉素耐藥性的鑒定，初步確定BC307為蠟樣芽胞桿菌。進一步分析證明，BC307屬于蠟樣芽胞桿菌ST26序列型，該序列型的成員如NC7401、AH187等均屬于產嘔吐毒素的高毒菌株[22]。因此進一步對BC307的ces基因簇進行擴增，發現BC307含有完整的ces基因簇，說明BC307也應是產嘔吐毒素的高毒力菌株，這也與病人食物中毒的嘔吐癥狀相符[23]。

青霉素敏感實驗也可以用于區分蠟樣芽胞桿菌與炭疽芽胞桿菌。炭疽芽胞桿菌一般對青霉素敏感，而多數蠟樣芽胞桿菌對青霉素類抗生素耐藥。在蠟樣芽胞桿菌β-內酰胺酶的調控系統中，RsiP是一個關鍵調控因子。本實驗成功構建了pET28a-sumo-rsiP重組表達載體，在大腸桿菌中sumo標簽大大提高了蛋白的可溶性表達，獲得了高純度RsiP蛋白。制備的RsiP蛋白鼠抗血清具有較高的效價，可用于蠟樣芽胞桿菌族成員的RsiP蛋白檢測，為進一步探究RsiP在青霉素抗性調控機制中的作用以及蠟樣芽胞桿菌耐藥性研究提供了實驗基礎。

此外，炭疽芽胞桿菌青霉素敏感的原因尚不清晰，有研究表明炭疽桿菌β-內酰胺酶基因沉默的原因可能是RsiP不被降解，但是沒有提供直接的實驗證據。是否因為炭疽芽胞桿菌RsiP存在突變位點?本研究發現，炭疽桿菌Ames株與蘇云金芽胞桿菌BT9727株相比，RsiP蛋白只在第84位存在一個I→S的突變，但此突變是否為炭疽芽胞桿菌RsiP無法被有效降的關鍵突變仍不得而知下一步研究將比對GenBank數據庫中所有已公布的蠟樣芽胞桿菌族的RisP序列，找到炭疽芽胞桿菌特有的突變位點，并利用CRSIPR-Cas9等方法對其進行編輯，驗證該猜測。同時，既然RsiP無法被降解，其是否有其他不可或缺的調控功能，下一步將構建青霉素調控因子的一系列缺失株及相應的回復株，并對其重要表型進行研究，綜合分析炭疽桿菌青霉素敏感的原因。