三種中藥對日本血吸蟲感染小鼠肝纖維化的抑制作用比較

摘要：目的 探討湖北海棠總黃酮、根皮苷、復方鱉甲軟肝片對日本血吸蟲所致小鼠肝纖維化的保護作用。方法 隨機將感染日本血吸蟲尾蚴小鼠分成5組，模型組（B）， 復方鱉甲軟肝片陽性組（C），湖北海棠總黃酮治療高劑量組114 mg/（㎏.d），根皮苷組 （E） 40 mg/（㎏.d），另設空白組（A），每組10只。感染后第42天， C、D、E組均用吡喹酮驅蟲治療500mg/（㎏.d）×2d，之后各組開始灌胃給藥持續治療60天，A組和B組用生理鹽水對照。實驗結束處死小鼠，留取肝臟組織和血清，測定血清中ALT、AST、HA的含量;計算肝體指數;測定肝組織中HYP含量;蘇木素-伊紅及Masson膠原纖維染色觀察小鼠肝組織變性、蟲卵肉芽腫與膠原沉積等病理改變。結果 與空白A組相比，B、C、D、E組小鼠肝臟有明顯蟲卵肉芽腫形成、膠原沉積與肝纖維化，伴有不同程度的肝細胞炎性損傷壞死;血清中ALT、AST、HA和肝組織中HYP含量均明顯升高（P<0.05或P<0.01）;與模型組B相比，湖北海棠總黃酮、根皮苷、復方鱉甲軟肝片均能明顯降低ALT、AST、HA和HYP含量及肝指數（P<0.05或P<0.01）;明顯減輕小鼠肝組織壞死與膠原沉積，減輕蟲卵肉芽腫的面積，三種藥物之間差異性不明顯。結論 湖北海棠總黃酮和根皮苷具有抗血吸蟲肝纖維化的作用。

關鍵詞：湖北海棠總黃酮;根皮苷;復方鱉甲軟肝片;日本血吸蟲;肝纖維化;

【中圖分類號】R28 ? ? ? ? ? ? 【文獻標識碼】A ? ? ? ? ? ? 【文章編號】2107-2306（2021）07--02

血吸蟲性肝硬化是血吸蟲蟲卵沉積在肝臟，可溶性蟲卵抗原引起的、以肝蟲卵肉芽腫和肝纖維化為特點的免疫疾病[1]。研究表明，吡喹酮治療后未成熟蟲卵仍可繼續發育，蟲卵肉芽腫反應仍在繼續，而且一旦肝纖維化達到一定程度，即使去除誘因，肝纖維化仍將繼續。因此在蟲卵肉芽腫形成階段和肝纖維化早期如何用藥物干預、控制其發展，成為吡喹酮治療后控制血吸蟲性肝病發展的關鍵。然而至今尚無高效低毒的藥物用于血吸蟲性肝病的治療。

湖北海棠（Malus hupehensis （Pamp.） Rehd.）為薔薇科蘋果屬植物，又名野海棠，花紅茶。主要分布在湖北、湖南、江西、江蘇、浙江、安徽等地[2]。湖北海棠嫩葉作茶葉飲用己有400多年的飲用歷史，是三峽地區夏季廣為飲用的清涼飲料，俗稱林擒茶[3] 。據研究，湖北海棠葉富含以根皮苷為主的黃酮類物質和Zn、Cr、Mn等多種礦物質[4]，具有降血糖、保肝護肝、抗病毒等作用，主要用于治療慢性肝炎、脂肪肝、急慢性肝損傷、高血糖、高血脂等[5]。本課題旨在研究湖北海棠葉總黃酮及根皮苷對血吸蟲感染所致蟲卵肉芽腫和肝纖維化的抑制作用，為湖北海棠葉在保肝護肝功能方面開發應用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1藥物及試劑

湖北海棠總黃酮：由天然產物研究與利用湖北省重點實驗室（三峽大學）提供，80℃溫水浸提湖北海棠葉三次，每次1h，合并浸提液過濾，上大孔樹脂柱用蒸餾水沖洗至流出液糖檢測陰性，用50%乙醇一次性洗出，回收溶劑并減壓干燥，得湖北海棠總黃酮，其主要成分為根皮苷，其含量為70%;根皮苷從湖北海棠總黃酮中抽提純化，純度98%;復方鱉甲軟肝片，內蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司，批號：20090625。吡喹酮片，南京制藥廠有限公司，批號：20090704。丙氨酸氨基轉移酶（ALT） 、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST），羥脯氨酸（HYP）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所，小鼠血清透明質酸（HA）ELISA試劑盒，上海研吉生物科技有限公司提供的美國R&D systems產品;其他試劑皆為分析純。

1.2實驗動物及釘螺

6～8周齡清潔級昆明種小鼠60只， 雌雄各半，體重20士2g，購自華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心，動物生產許可證號為：SCXK（鄂）2009-0007;將動物置于室溫25℃環境下，飼養籠飼養，自由飲水，以全價顆粒飼料喂養[3]。感染中國大陸株日本血吸蟲尾蚴的陽性釘螺，購自江西省寄生蟲病防治研究所。

2 方法

2.1感染及分組

按常規將釘螺放入去氯離子自來水中逸出尾蚴，將50只小鼠經腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴40～50條/只，然后隨機分成5組：模型組（B）; 復方鱉甲軟肝片（C）;湖北海棠總黃酮組（D）、根皮苷（E）;另外10只未感染小鼠為空白組（A）。于感染后第42天，B、C、D、E組均給予吡喹酮灌胃治療：500mg/（㎏.d）×2d，A組以生理鹽水灌胃對照。接著C組給予灌胃復方鱉甲軟肝片1000mg/（㎏.d）×60d，D組灌胃湖北海棠總黃酮114 mg/（㎏.d）×60d，E組灌胃根皮苷40 mg/（㎏.d）×60d， A組和B組均以生理鹽水作為對照灌胃。

2.2檢測指標和方法

2.2.1血清樣品的收集

末次給藥后，禁食不禁水過夜，24小時后摘眼球取血，分離血清，用全自動生化分析儀檢測血清中ALT和AST的水平，ELISA法檢測血清中HA的含量，具體操作方法按照試劑盒說明書進行。

2.2.2肝組織樣品處理

取小鼠肝臟，用4℃預冷的生理鹽水沖盡表面浮血，濾紙拭干、稱重，按肝體指數=[肝臟重量（g）/體重（g）]×100公式計算小鼠肝體指數;然后取小鼠肝臟右葉同一部位切成4mm薄片， 4%中性甲醛固定，石蠟包埋，制作厚4μm 連續切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡觀察肝組織中蟲卵肉芽腫的大小;膠原纖維染色（Masson染色），光鏡觀察膠原沉積情況，并應用圖像分析系統計算膠原纖維的面積。每只小鼠做一張切片，每張切片隨機取5個視野，計算每個視野中藍色膠原分布的面積，其和為該切片纖維化面積，用于判斷肝纖維化程度;另取肝組織0.1g測定其中HYP的含量，操作方法按照HYP試劑盒說明書進行。

2.2.3數據處理

所有數據均以均數±標準差（ ）表示，統計方法采用單因素方差分析，統計數據采用SPSS 13.0處理。

3結果

3.1血清HA、ALT、AST含量

與空白組A相比，模型組B和各治療組C、D、E血清中HA、ALT、AST含量均升高，其中模型組最高。而C、D、E組與模型組B相比，總黃酮、根皮苷和鱉甲軟肝片均能顯著降低血清中ALT、AST、HA含量（P<0.05或，P<0.01）。（見表1）

3.2 肝組織中HYP含量

空白組A中HYP含量極低，模型組B和各治療組C、D、E肝組織中HYP含量均明顯升高，其中模型組最高。而C、D、E組與模型組B相比，總黃酮、根皮苷和鱉甲軟肝片均能顯著降低肝組織中HYP含量（P<0.05或P<0.01），也能明顯降低小鼠的肝體指數（P<0.05或P<0.01）。（見表1）

3.3 肝臟組織病理變化

A組（空白組）小鼠肝臟表面光滑，紅褐色，鏡下見肝細胞沿肝小葉呈放射狀分布，Masson染色未見藍色膠原沉積。B組（模型組）小鼠肝臟明顯增大，表面布滿大小不一的灰白色的顆粒，鏡下見大量蟲卵肉芽腫。匯管區及蟲卵肉芽腫周圍纖維增生明顯，大部分蟲卵肉芽腫出現壞死病灶及纖維化，肝血竇擴張充血，大量炎性細胞浸潤。蟲卵肉芽腫周圍以及匯管區大量藍色膠原沉積。C、D、E組小鼠肝臟輕微增大，質地中等，表面灰白色結節明顯少于B組，鏡下蟲卵肉芽腫的面積和數量明顯減小，藍色膠原沉積的面積明顯低于模型組，肝纖維化程度明顯降低。C、D、E之間差異不顯著（見表1）。

4討論

肝臟的纖維化是纖維增生和分解不平衡導致肝纖維組織過度沉積的結果。反復或持續的肝損傷或炎性病變，可使細胞外基質（ECM） 合成過多而降解相對不足，從而形成肝纖維化。肝星狀細胞（HSC）是目前被公認的ECM的主要來源細胞，HSC的激活是肝纖維化形成初始的中心環節[6]。血清HA是反映肝細胞細胞外基質代謝的血清學指標，與肝纖維化程度有明顯的相關性。HA為糖胺多糖類物質，在肝內由HSC合成并釋放入血循環中，而肝細胞可清除和降低循環血液中HA。肝纖維化時，由于HSC的增殖和激活以及肝細胞的功能下降，致使HA不但合成增加，而且清除率下降。所以，HA是反映肝纖維化的敏感指標也可反應肝纖維化程度[7-8]。

近來的研究報道顯示海棠總黃酮對慢性肝炎、脂肪肝、急慢性肝損傷等有很好的保護作用，總黃酮中主要的活性充分是根皮苷。本實驗通過建立血吸蟲感染性肝纖維化模型，給予湖北海棠總黃酮和根皮苷治療后，結果顯示其總黃酮和根皮苷均能明顯改善日本血吸蟲感染引起的肝臟病理變化，減小肝臟蟲卵肉芽腫面積，降低肝臟組織中HYP含量，減少膠原纖維在肝臟組織中沉積，且降低血清中ALT、AST、HA的水平，對血吸蟲性肝纖維化有確切的治療效果，且兩組之間差異不顯著，證明在抑制肝纖維化過程中，起主要作用的是根皮苷。復方鱉甲軟肝片是目前臨床用于治療肝纖維化的中成藥，湖北海棠總黃酮和根皮苷在改善肝纖維化中的作用與復方鱉甲軟肝片相比效果相當，其作用機制可能與降低血清中透明質酸酶的含量有關。

作者認為，湖北海棠葉總黃酮及其純化產物根皮苷可以作為吡喹酮治療血吸蟲病的輔助用藥，用吡喹酮有效殺蟲治療的同時，如能盡早服用湖北海棠總黃酮或根皮苷，有可能改善血吸蟲病患者肝纖維化的預后。且湖北海棠經濟實惠，具有開發利用價值。

參考文獻：

[1]Boros DL. Immunopathology of schistosoma mansoni infection. [J]. Clin Microbiol Rec， 1989， 2：250-259

[2] 中國科學院武漢植物研究所編. 湖北植物志 [M]. 武漢市： 湖北科學技術出版社，2002

[3] 方榮，楊茜，李莉，等. 湖北海棠中根皮苷含量測定[J]. 食品科技， 2008，（6） 195-196

[4] 馮雪嬌，曹學麗，李艷，等. 根皮苷的應用及分離純化研究進展[J]. 北京工商大學學報（自然科學版）， 2008， 26（4）： 13-16

[5] 王春玲，王鵬，張占偉. 湖北海棠對小鼠血糖的影響[J]. 基層中藥雜志，1999，13 （2）： 19-20

[6] Friedman SL. Mechanisms of Disease： mechanisms of hepatic fibrosis and therapeutic implications. [J]. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol， 2004， 1： 98-105.

[7] Massart C， Bendavid C， Gibassier J， et al. Importance of the functional sensitivity determination of a serum hyaluronic acid assay for the prediction of liver fibrosis in patient s with feature of the metabolic syndrome [J].Clin Chem Lab Med，2006， 44 （4）：505-507.

[8] Kopke-Aguiar LA， Martins JR， Passerotti CC， et al. Serum hyaluronic acid as a comprehensive marker to assess severity of liver disease in schistosomiasis[J] . Acta Trop， 2002， 84： 117-126.

作者簡介：杜幼芹（1972-），女，漢族，碩士，副教授，主要研究方向：寄生蟲感染免疫。