貓傳染性腹膜炎病毒N蛋白的原核表達及多抗制備

牛 錚， 徐沙沙， 張靜怡， 張依玲， 闞子斐，張淑娟， 鄒 宏， 鄒卓嵐， 冉 玲， 宋振輝

1. 西南大學 動物醫學院，重慶 榮昌 402460；2. 西南大學 醫學研究院免疫學研究中心，重慶 榮昌 402460

貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)可導致貓科動物傳染性腹膜炎(FIP)的發生，使貓科動物內臟器官出現肉芽腫病變、腹腔出現大量腹水以及腹膜出現炎癥[1]．FIP的流行病學特點是傳染率和死亡率都比較高，感染途徑主要是口鼻，經呼吸道、消化道或昆蟲媒介進行傳播[2]．目前研究表明，貓傳染性腹膜炎病毒是因貓冠狀病毒發生突變而產生的[3]．貓冠狀病毒突變為貓傳染性腹膜炎病毒后，在巨噬細胞內進行復制，然后脫離腸道轉移至臟器或腹腔，從而引發傳染性腹膜炎[4]．迄今為止該病僅能做到在臨床上緩解輕微癥狀，延長患貓的壽命，但難以治愈[5]．目前使用常規疫苗和重組疫苗對貓傳染性腹膜炎進行預防均沒有取得理想的效果．研究發現，FIPV的感染具有抗體依賴性增強現象[6]，而大部分貓體內都存在貓冠狀病毒，如果接種強毒株反而會加劇貓傳染性腹膜炎的發作．

貓傳染性腹膜炎病毒主要編碼了刺突蛋白、膜蛋白、小包膜蛋白和核衣殼蛋白4種結構蛋白[7]．研究表明，冠狀病毒的核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein，N蛋白)作為一個多功能蛋白，能包裝病毒的基因組形成核糖核蛋白復合體，與病毒的基因組之間存在相互作用，這對病毒粒子的裝配有重要影響[8]．同時，N蛋白作為免疫原性最強的蛋白，其對應的抗體是最早產生的，所以N蛋白常被用來作為早期診斷的指標[9]．本實驗在前人研究的基礎上，對FIPV的N基因進行了克隆和原核表達，并以純化后的重組N蛋白作為抗原皮下免疫比利時兔，制備出了相應的多克隆抗體．旨在為進一步研究N蛋白的生物學功能奠定基礎，同時豐富FIPV檢測技術體系以及為FIP的進一步研究和臨床治療奠定基礎．此外有研究表明，FIPV與豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)有相近的抗原性，FIP病貓的血清和腹腔液中可檢出對TGEV的高價中和抗體[10]．FIPV N蛋白多抗的制備，也為進一步研究FIPV與TGEV之間的關系提供了可能．

1 材料與方法

1.1 材 料

含FIPV病料收集自重慶市某動物醫院患病致死貓．經基因測序鑒定后，放置于-80 ℃速凍保存備用．

山羊抗鼠HRP-IgG，山羊抗兔HRP-IgG購自BBI公司，FIPV N蛋白鼠源單克隆抗體為實驗室保存；氯霉素，卡那霉素，DL 1 000 Marker，DL 5 000 Marker，DL 10 000 Marker，2×Taq Master Mix，PrimeScriptTMRT Master Mix購自TaKaRa公司；E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit DNA購自Omega Bio-tek公司；Enhanced BCA Protein Assay Kit試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；LB購自Biowest公司；蛋白純化試劑盒ProteinIso Ni-NTA Resin購自北京Transgen公司．

1.2 方 法

1.2.1 引物的設計與合成

根據FIPV轉錄組數據N基因的序列，采用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物，并且在引物上增加限制酶EcoRⅠ和SalⅠ的酶切位點，預計擴增片段長度為967 bp，上下游引物信息見表1．引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成．

表1 引物擴增序列

1.2.2 FIPV總RNA的提取及反轉錄

采用Trizol試劑分別對因患FIPV而致死的貓肝臟、腎臟、胃、小腸等組織的總RNA進行提取，采用核酸測定儀檢測總RNA的濃度和純度，以提取的FIPV總RNA為模板，按照PrimeScriptTMRT Master Kit試劑盒說明合成cDNA．

1.2.3N基因的克隆

以FIPV的cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系(12.5 μL)：2×Taq Master Mix 6.25 μL，上下游引物各0.5 μL，dH2O 4.25 μL，模板1 μL．PCR反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環，72 ℃延伸10 min．

按照Omega Bio-tek的E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit DNA膠回收試劑盒進行PCR產物的回收，與pMD19-T載體進行連接，轉化Trans5α感受態細胞，涂布于含16 μL IPTG(24 mg/mL)和38 μL X-GAL(20 mg/mL)的LB/Amp+瓊脂平板中，于37 ℃恒溫培養箱培養13 h，然后對陽性克隆進行菌液PCR鑒定．

1.2.4 N蛋白的原核表達

將鑒定正確的質粒命名為pMD19-T-N，將pMD19-T-N和Pet-28a用EcoRⅠ和SalⅠ進行雙酶切，將酶切產物進行切膠回收純化，構建Pet-28a-N重組表達質粒，經菌液PCR、雙酶切驗證后，轉入大腸桿菌Rosetta感受態細胞，挑取單菌落接種于LB(Kana+/Camr)的液體培養基中，于37 ℃下200 r/min振蕩培養3 h，測菌液OD600值為0.6～0.8，加入IPTG進行誘導，具體濃度及時間見表2，將菌液于4 ℃，7 500 r/min離心20 min，收集菌體，超聲波破碎，分別收集上清和沉淀，并進行SDS-PAGE電泳檢測．檢測到目的蛋白后，再分別參照表2進行時間和IPTG濃度的優化．

表2 不同表達條件

1.2.5 N蛋白的純化及鑒定

采用鎳柱親和層析的方法對重組蛋白進行純化．首先分別用15 mL包涵體洗涂液I-V重懸包涵體沉淀，4 ℃，7 000 r/min離心20 min后，在包涵體中加入30 mL(pH值為8.0)8 mol/L尿素使其變性溶解，靜置過夜；4 ℃，7 000 r/min離心20 min，收集上清，棄去沉淀，上清用0.45 μm濾器過濾．再參照ProteinIso Ni-NTA Resin 的具體步驟進行蛋白純化，SDS-PAGE檢測最適純化結果，以最佳咪唑濃度對蛋白進行純化．將純化的N蛋白進行Western Blot鑒定(一抗為FIPV N蛋白鼠源單克隆抗體，二抗為山羊抗鼠HRP-IgG抗體)．

1.2.6 多克隆抗體的制備、特異性鑒定

選擇2只健康的比利時雄兔在脊柱兩側皮下進行多點注射免疫，采用1，15，30，45 d的免疫周期，免疫劑量為100 μg/kg．首次免疫周齡為12周齡，體質量為2.5 kg．免疫30 d后耳緣靜脈采血2 mL，將裝有血液的EP管呈45～60度角于室溫放置1 h，4 ℃靜置過夜．用移液槍將析出的血清轉移至1.5 mL EP管內，4 ℃，2 500 r/min離心30 min，分裝至PCR管內，封口膜封口后-80 ℃保存備用．免疫后45 d于耳緣靜脈采血2 mL，步驟同上．

Western Blot鑒定多克隆抗體與重組N蛋白的反應性．將制備的多克隆抗體用TBST按1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶6 000的比例稀釋作為一抗．將山羊抗兔HRP-IgG用TBST按1∶5 000的比例稀釋作為二抗．

以實驗得到的多克隆抗體作為一抗對病死貓的低溫恒冷組織切片進行免疫組織化學實驗以驗證其是否具有特異性，并以實驗室保存的FIPV鼠源單克隆抗體制備的免疫組化切片作為陽性對照．本實驗中，FIPV鼠源單克隆抗體使用山羊抗鼠HRP-IgG，制備的FIPV兔源多克隆抗體使用山羊抗兔HRP-IgG作為二抗，最后使用DAB顯色液進行顯色、染色．

2 實驗結果

2.1 N基因的克隆及原核表達載體的構建

分別對病死貓肝臟、腎臟、胃、小腸等組織進行檢測，電泳檢測顯示所有組織的PCR產物中均可見1條約967 bp特異性條帶(圖1a)．將該序列克隆至pMD19-T載體，測序結果顯示序列長度為3 659 bp(含限制性內切酶識別序列和保護堿基)；通過ORF Finder預測N基因的開放閱讀框，可知該基因從第1個堿基到第1 131個堿基為一個完整的CDS，共編碼377個氨基酸，編碼的蛋白為N蛋白．將該CDS序列克隆至Pet-28a表達載體，經雙酶切鑒定，結果表明目的基因成功連接到Pet-28a載體上(圖1)．

M為DNA相對分子質量標準；(a) N基因的PCR產物擴增(1為肝臟，2為腎臟，3為胃，4為小腸，5為陰性對照)；(b) N基因膠回收鑒定(1為回收N基因)；(c) pMD19-T-N質粒的鑒定(1為陽性重組pMD19-T-N質粒)；(d) pMD19-T-N質粒的雙酶切鑒定(1為雙酶切重組質粒pMD19-T-N)；(e) 重組Pet-28a-N質粒的鑒定(1為陽性重組Pet-28a-N質粒)；(f) Pet28a-N質粒的雙酶切鑒定(1為雙酶切重組質粒Pet-28a-N)．

2.2 N蛋白的表達形式及條件優化

將陽性重組質粒Pet-28a-N轉化至大腸桿菌Rosetta感受態細胞后，在IPTG誘導下重組N蛋白以包涵體形式表達，蛋白的大小約為39 kD，與理論預測值相符(圖2)．對誘導表達條件進行優化，誘導溫度為16 ℃，誘導時間為8 h，IPTG濃度為1.0 mmol/L時為誘導最佳條件，目的蛋白表達效率最高(圖3和圖4)．

M為蛋白相對分子質量標準．1為Pet-28a-N誘導表達破碎后沉淀；2為Pet-28a-N未誘導上清；3為Pet-28a-N誘導表達破碎后上清；4為Pet-28a(空載體)誘導破碎后上清．

M為蛋白相對分子質量標準．1～9為Pet-28a-N誘導沉淀，其中1，4，7為由0.6 mmol/L IPTG誘導，分別在4，6，8 h下產生的沉淀；2，5，8為由0.8 mmol/L IPTG誘導，分別在4，6，8 h下產生的沉淀；3，6，9為由1.0 mmol/L IPTG誘導，分別在4，6，8 h下產生的沉淀．

M為蛋白相對分子質量標準．1～9為1.0 mmol/L IPTG誘導Pet-28a-N產生的沉淀，其中1，2，3為在4 h下產生的沉淀；4，5，6為在6 h下產生的沉淀；7，8，9為8 h下產生的沉淀．

2.3 N蛋白的純化及鑒定

利用優化的條件大量誘導表達重組蛋白，參照Transgen的ProteinIso Ni-NTA Resin對變性后的N蛋白進行4次純化，結果如圖5．洗脫后經檢測在39 kD處有目的蛋白，與預期大小相符．將純化的N蛋白進行Western-Blot鑒定，結果顯示，在39 kD處出現的目的條帶，與實際的N蛋白大小一致(圖6)．

M為蛋白相對分子質量標準．1為未純化的包涵體蛋白；2為第1次洗脫液；3為第2次洗脫液；4，5，6和7為洗滌液；8為第3次洗脫液；9為第4次洗脫液．

M為蛋白相對分子質量標準．1為過柱純化第1次洗脫液；2為過柱純化第2次洗脫液；3為切膠純化蛋白；4為空載體陰性對照．

2.4 包涵體總蛋白與N蛋白濃度的測定

參照Enhanced BCA Protein Assay Kit 試劑盒測包涵體總蛋白濃度，標準曲線如圖7．R2=0.998 4，表明擬合程度較好，根據標準曲線方程計算出包涵體總蛋白的濃度為1 320 μg/mL．

圖7 包涵體總蛋白濃度的測定

將處理后的標準蛋白和包涵體沉淀按照2，4，6，8，10 μL的體積加入到SDS-PAGE膠的泳道內，結果如圖8．利用Image J軟件，由灰度比和加樣體積定量出N蛋白濃度為950 μg/mL．

M為蛋白相對分子質量標準．1，2，3，4，5分別為2，4，6，8，10 μL BSA標準蛋白；6，7，8，9分別為2，4，6，8 μL待測重組N蛋白．

2.5 多克隆抗體特異性鑒定

以采取到的耳緣靜脈血清稀釋后作為一抗、山羊抗兔HRP-IgG稀釋后作為二抗，Western-Blot檢測多克隆抗體與重組N蛋白的反應性，結果如圖9．不同稀釋度的多克隆抗體均能與重組N蛋白反應，表明家兔3免后可產生有效抗體，與重組N蛋白反應性良好，稀釋度可達1∶6 000．同時也發現，在將血清與TBST按照1∶4 000的比例進行稀釋后，抗體的反應性最好．

圖9 多克隆抗體特異性檢測

查閱DAB染液說明可知，經過DAB染液染色后HRP二抗呈現棕色．將病變的肝臟組織免疫組化切片放在顯微鏡下觀察，可在病變組織表層黏膜處發現明顯陽性結果(圖10)，因此可證明本實驗制備的多克隆抗體能夠較好地與FIPV特異性結合．

圖10 多克隆抗體與FIPV特異性結合檢測

3 討 論

抗體作為一種研究工具，在目前的診斷、科研以及醫學治療等工作中起到舉足輕重的作用[11]．多克隆抗體是針對各種抗原決定簇產生的，其優點是制備周期相對較短，并且應用廣泛，包括抗原物質的鑒別、定位、分析和純化，以及作為疾病的診斷、檢疫試劑和治療制劑等[12]．因此，在科研領域中多克隆抗體的使用相對較多．

本實驗選用N蛋白作為抗原物質，主要是因為N蛋白作為FIPV的主要結構蛋白，與病毒的致病性密切相關，其不僅能與病毒基因組RNA結合，參與病毒的轉錄與復制，而且具有較強的抗原性，誘導的細胞免疫應答能促進病毒清除[13]．用純化后的N蛋白作為抗原，能刺激網狀內皮細胞系統產生相應的抗體．而本研究選用雄性家兔作為免疫對象來制備多克隆抗體，原因是家兔是最適合制備抗體的動物，制備后可采集量較大，性格相對溫順，易于進行免疫注射和采血操作[14]．選用雄性家兔不僅可避免雌性家兔因性周期帶來免疫系統的波動，也可避免因雌性家兔妊娠而使實驗被迫終止．

Pet系統載體是目前應用最廣泛的表達載體[15]．其宿主菌Rosetta為高效率表達菌株，生長速度快，可在短時間內產出大量蛋白[16]．然而，表達速度過快容易導致蛋白質二硫鍵不能進行正確的配對，過多蛋白間的非特異性結合，從而形成不可溶形式的包涵體[17]．為了獲取天然有活性的目的蛋白，包涵體首先需要進行純化，然后使用變性劑進行變性溶解，再進行復性操作，去除變性劑[18]．

實驗過程中通過蛋白切膠回收可以獲得純度較高的蛋白，但該方法操作略顯煩瑣，難以大批量純化蛋白，因此，重組N蛋白的純化與復性條件還需要進一步的探索．含有目的蛋白的SDS-PAGE膠研磨后無需與免疫佐劑混合可直接免疫動物，原因是聚丙烯酰胺可以作為佐劑，提高抗原對機體的免疫原性，延緩抗原的釋放，延長抗原在體內的停留時間，從而提高產生抗體的效價[19]．一般情況下，二免后即可耳緣靜脈采血分離出血清，通過Western-Blot與免疫組織化學方法檢測抗體的特異性并初步檢測其效價．

本實驗對FIPV的N基因進行了克隆與原核表達，并利用純化后重組N蛋白免疫家兔制備出多克隆抗體，為下一步包被N蛋白建立間接ELISA檢測未知抗體或包被純化后的多克隆抗體建立雙夾心法ELISA檢測未知抗原打下堅實基礎．N基因的表達為進一步研究N蛋白在感染過程中的作用機理及基因工程亞單位疫苗的研制奠定了基礎．然而，重組N蛋白的純化與復性的條件、多克隆抗體純化方式的優化還需要進一步研究．