一氧化氮信號通路與動脈粥樣硬化

萬 函，王秀芬，楊美雯，楊 蓓，吳 磊，洪芬芳，楊樹龍

(1.南昌大學a.基礎醫學院生理教研室；b.醫院護理部；c.基礎醫學院病原生物學實驗中心，南昌 330006；2.南昌市衛生學校外科教研室，南昌 330008)

動脈粥樣硬化(AS)是動脈硬化中常見且重要的一種血管病變，是一個復雜的病理過程[1]，同時也是導致冠狀動脈疾病(CAD)、心力衰竭、中風等心腦血管疾病的根本原因。一氧化氮(NO)作為內皮衍生的舒張因子，是體內第一個被認為是信號傳導介質的氣體分子，不同條件下生成的NO對AS有抑制或促進作用，但其發病機制尚未完全闡明。本文就NO信號通路與AS的關系進行綜述，為AS相關研究提供參考。

1 動脈粥樣硬化的病理特點及其發病機制

AS是脂質在動脈中堆積、纖維化，形成內膜斑塊后導致血管硬化、管腔狹窄和相應器官的缺血性改變[2]，是導致斑塊發生發展和動脈血管進行性狹窄的炎性疾病。盡管對于斑塊的形成、發展的病理過程尚無定論，但現有研究[1]顯示吸煙史、高血壓、冠心病、糖尿病、高血脂、飲酒等危險因素會加劇動脈粥樣硬化的發生與發展。AS起始于動脈內膜的內皮細胞的激活，并引發單核細胞的募集和積累，其分化成巨噬細胞并吞噬脂質，變成泡沫細胞[3]。單核細胞通過清道夫受體(SR)依賴性攝取氧化低密度脂蛋白(oxLDL)，以及SR非依賴性攝取天然和修飾的oxLDL，轉化成泡沫細胞[4]。oxLDL明顯破壞了eNOS/iNOS的調節機制，通過HMGB1-TLR4-Caveolin-1途徑下調了eNOS表達。另一方面，增加的oxLDL導致清道夫受體LOX-1的持續活化，并隨后導致NF-κB活化，進而增加iNOS，從而導致內皮細胞氧化應激[5]。泡沫細胞產生高水平的促炎細胞因子，趨化因子和生長因子，引起平滑肌細胞增殖和遷移到內膜中，導致斑塊生長和纖維化。AS斑塊可以發展成穩定或易損斑塊，其中大部分斑塊是穩定的[6]。而破裂的斑塊通常具有巨噬細胞大量滲透的纖維帽。這些巨噬細胞在斑塊破裂的位點被激活，并能夠通過吞噬作用或通過刺激金屬蛋白酶的產生降解細胞外基質，這削弱了纖維帽并使斑塊易于破裂。由于巨噬細胞和SMC浸潤的內膜增生，血管管腔明顯變窄，引起相應器官缺血性改變[6]。

現已有多種假說來解釋AS的形成，包括動脈壁中膽固醇的沉積，病毒或細菌感染，損傷的應激反應，局部動脈炎癥和自身免疫應答等。但AS發病機制復雜，其確切發病機制仍不清楚。目前關于AS發病機制的觀點有：1)基因組中DNA甲基化對AS的發展起重要作用。DNA甲基轉移酶在維持內皮細胞完整性，促進平滑肌細胞增殖和在動物模型中誘導動脈硬化形成中是關鍵[7]。2)線粒體功能受損和線粒體組分如線粒體DNA(mtDNA)損傷可能直接參與AS形成。有報道[8]顯示至少4個線粒體基因組突變，即MT-RNR1基因中的A1555G，MT-TL1基因中的C3256T，MT-TL2中的G12315A和MT-CYB基因中的G15059A與人主動脈內膜中的脂肪纖維斑塊相關。3)內皮細胞代謝紊亂引起其功能障礙，進而促進AS形成[3]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(PGC-1α)是AS相關的細胞能量代謝的主要調節劑。有研究[9]表明在AS中miR-19-3p，miR-221-3p和miR-222-3p通過靶向PGC1α轉錄調制PGC-1，進而導致內皮細胞功能障礙。4)炎癥和自身免疫性疾病也與AS形成有關。AS形成之初是由促炎Th1細胞和細胞因子免疫應答驅動。新觀點包括由大多數無菌性炎癥疾病共享的Th17/Th1軸?？寡譚h2細胞和細胞因子免疫應答與前兩者一起引發，后者抑制它們的有害反應，最終導致完全的AS[10]。白細胞介素-33是IL-1細胞因子超家族的新成員，通過介導免疫反應的Th1到Th2轉換參與抗AS反應。

2 一氧化氮在動脈粥樣硬化中的作用

血管內皮NO生物利用度降低在AS進展中起關鍵作用。NO生物利用度的喪失，例如，底物(L-精氨酸)缺乏或eNOS的輔因子缺乏總導致有害的血管作用，如內皮功能受損和平滑肌細胞增殖增加，eNOS的底物(精氨酸)或輔助因子。各種不良反應低的藥用植物及其生物活性化合物或次生代謝產物與預防心血管疾病有關，這可能與其通過增加NO的生物利用度，從而改善內皮功能障礙[11]。

NO由3種不同種型的一氧化氮合酶(NOS)合成，即eNOS，nNOS和iNOS。血管系統中的大多數NO由eNOS產生。內皮衍生的一氧化氮(eNO)是一種多功能信號分子，其作為有效的內源性血管擴張劑，能抑制血管損傷形成中的關鍵過程。eNO能減少ROS產生和減弱脂質過氧化，發揮抗AS作用[12]。此外，eNO還具有抑制血小板粘附和聚集，抑制粘附分子和趨化因子表達，減少炎癥細胞浸潤和平滑肌細胞遷移和增殖的作用。nNOS在AS中起到血管保護作用的第一個證據來自WILCOX等的工作，其顯示斑塊形成的進展和nNOS mRNA之間的相關性，這與動物實驗顯示的nNOS-KO小鼠加速新生內膜形成和收縮血管重塑的早期研究相一致[13]。在炎癥條件下，血管細胞可以表達iNOS，其產生大量的NO導致血管功能障礙。實驗結果表明脂聯素的抗AS作用正是通過抑制iNOS而減弱氧化/氮化應激，減少超氧化物和ONOO-產生[14]。由此可見，生理情況下產生的NO具有抗AS的作用，而病理條件下生成的NO將引發或者加速AS。增強NO信號傳導的遺傳易感性與降低冠心病，外周動脈疾病和中風的風險有關。NO信號的藥理刺激可能被證明可用于預防或治療心血管疾病[15]。eNOS可作為預防和治療AS的重要靶點[16]。

3 一氧化氮合成通路與動脈粥樣硬化

3.1 eNOS相關的一氧化氮信號通路與AS

3.1.1 PI3K/AKT/eNOS/NO通路與AS

OxLDL結合LOX-1觸發NADPH氧化酶的活化，產生活性氧(ROS)和脂質過氧化物自由基。此外，OxLDL誘發PI3K/AKT/eNOS/NO通路障礙導致NO生成減少，以及NO清除超氧化物陰離子、防止超氧化物陰離子形成其歧化產物和氫過氧化物的能力受損，最終導致內皮細胞損傷[17]。PI3K介導的Akt的活化涉及其在蘇氨酸308和絲氨酸473上的磷酸化，活化的Akt通過激活eNOS產生NO[17]。磷酸肌酸(PCr)[17]、Myricitrin通過激活PI3K/AKT/eNOS/NO通路抑制ox-LDL誘導的人臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)凋亡和減少AS斑塊形成。高脂肪飲食誘導的AS大鼠模型和小鼠模型中的血管內皮功能障礙通過藥物上調PI3K，AKT的mRNA和蛋白表達，增加eNOS磷酸化而緩解[18]。

有實驗[19]對具有抗AS作用的乙酸甲酯的乙醇提取物(ERA)、顆粒蛋白、骨鈣蛋白(OCN)處理的HUVEC中NOS-NO信號進行評估，結果表明ERA、顆粒蛋白、OCN處理的HUVEC中通過PI3k/Akt通路誘導eNOS磷酸化，NO水平顯著上調。同時上述作用可被PI3K抑制劑和Akt抑制劑阻斷[19]。ERA在動物實驗中誘導分離的胸主動脈血管舒張被L-NAME(NOS抑制劑)消除[19]。

GONG等[20]選入40例頸動脈粥樣硬化患者。3個月的時間內，每天給予患者奧美沙坦20 mg。研究結果顯示奧美沙坦可以增加循環內皮祖細胞數量和eNOS和NO的血清水平。Spearman秩相關分析顯示奧美沙坦對內皮祖細胞動員的促進作用與臨床特征(如性別，年齡，血壓等)之間無相關性(均P>0.05)。并得出奧美沙坦依賴于PI3K/AKT/eNOS/NO通路有效促進內皮祖細胞動員并提高其在頸動脈粥樣硬化患者的功能的結論[20]。

鳶尾素(irisin)、腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)、Vaspin通過激活PI3K/AKT/eNOS/NO通路，增加NO產生，抑制HUVEC中高葡萄糖誘導的凋亡、氧化應激、NADPH氧化酶的生成和增加抗氧化酶表達，改善糖尿病相關的AS[21-22]。

二氫楊梅素(DMY)[23]降低了microRNA-21(miR-21)并增加了其靶基因二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1(DDAH1)的表達，這種作用降低了不對稱氨乙精胺(ADMA)的水平，并增加了內皮NO合酶(eNOS)的磷酸化和NO的產生培養的HUVEC，動脈粥樣硬化病變的血管內皮和肝臟。DMY抑制Ox-LDL誘導的巨噬細胞M1型極化，其機制可能與激活JAK3/STAT5信號通路有關[23-24]。

3.1.2 Ca2+/CaMKK或CaMKII/AMPK/eNOS/NO通路與AS

eNOS是受鈣池操作性鈣內流(SOCE)調節的Ca2+依賴性酶，SOCE抑制劑誘導eNOS活性受損。YAMAGATA等[25]發現白細胞介素-1β(IL-1β)增強黏附分子的表達、減少NO生成并誘導動脈硬化。在培養的人內皮細胞中加入IL-1β，結果表明IL-1β降低Ca2+/CaMKII，PI3K，eNOS的表達，而增加細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)的表達，提示IL-1β誘發的AS與Ca2+/CaMKII/eNOS/NO途徑異常有關[25]。

β-胡蘿卜素和樺木酸(BA)具有預防AS的作用，其通過Ca2+/CaMKK或CaMKII/AMPK/eNOS/NO途徑介導[25-26]。實驗研究[25-26]表明，添加β-胡蘿卜素培養的人內皮細胞[25]、添加BA培養的EA.hy926 cells[26]中誘導的AMPK、eNOS磷酸化和NO生成水平增加。同時細胞內鈣離子和鈣離子/鈣調蛋白依賴性激酶IIα(CaMKIIα)和鈣離子/鈣調素依賴蛋白激酶激酶β(CaMKKβ)的磷酸化水平提高。并且運用AMPK抑制劑化合物C、L型鈣離子通道(LTCC)抑制劑、W7(CaM拮抗劑)、KN-93(CaMKII的選擇性抑制劑)和STO 609(CaMKK的選擇性抑制劑)處理降低eNOS磷酸化和NO產生水平。

3.1.3 Nrf2/HO-1/eNOS/NO通路與AS

核因子紅細胞2相關因子2(Nrf2)是一種氧化還原敏感的轉錄因子，通常存在于細胞質中，與Kelch樣ECH相關蛋白(Keap)-1結合，Nrf2在確保NO的持續釋放和保護免于凋亡中起重要作用。血紅素加氧酶-1(HO-1)是一種抗氧化和抗炎癥的誘導性酶，Nrf2被氧化應激激活后，進入細胞核，并與HO-1啟動子中富含AU的元件結合以觸發HO-1基因表達。有實驗[27]證明尋常草枯草的水提物(APV)可誘導PI3K/Akt介導的Nrf2激活，抑制Keap1降解，進而誘導HO-1和eNOS的活化，增強NO的生成，從而抑制糖尿病相關的AS。

3.1.4 AMPK/AKT/eNOS/NO通路與AS

在人類內皮細胞和血管中通過激活AMPK增加eNOS磷酸化促進NO分泌；AMPK和AKT都是血管中eNOS活性的重要調節因子。有研究[27-28]表明在AS中oxLDL誘導的內皮氧化涉及AMPK/AKT/eNOS/NO通路的減弱。HUNG等[27]用oxLDL處理人臍靜脈內皮細胞，用或不用槲皮素預處理。結果顯示槲皮素對抗oxLDL引發AMPK活性降低，降低oxLDL活化的NOX2和NOX4。然而，AMPK減少了槲皮素抗氧化損傷的保護功能。同時，oxLDL抑制AKT/eNOS/NO，導致線粒體功能障礙，增強活性氧形成。OU等[28]用oxLDL處理人臍靜脈內皮細胞，用或不用銀杏葉提取物(GbE)預處理。Western印跡結果顯示GbE抑制NADPH氧化酶亞基p47(phox)和Rac-1的膜易位，并減弱由oxLDL誘導的AMPK去磷酸化和隨后激活的PKC引起的膜亞基gp91和p22(phox)的蛋白表達的增加。已經暴露于GbE的AMPK-α(1)特異性小干擾RNA轉染細胞隨后接觸oxLDL顯示PKC和p47(phox)水平升高。此外，暴露于oxLDL導致AMPK介導的Akt/eNO信號傳導的減少[28]。

3.1.5 STAT3/DDAH/ADMA/eNOS/NO通路與AS

STAT3是調節細胞存活，炎癥和血管生成的關鍵轉錄因子。不對稱二甲基精氨酸(ADMA)，是由蛋白質中的精氨酸殘基甲基化，并通過二甲基精氨酸二甲氨基水解酶(DDAH)代謝為瓜氨酸和二甲胺，是eNOS的內源性競爭性抑制劑[29]。JUNG等[29]研究表明，在Sprague-Dawley(SD)大鼠分離的主動脈模型中，vaspin通過STAT3介導影響DDAH Ⅱ啟動子活性，降低ADMA和活化的DDAH Ⅱ基因表達的水平，最終以STAT3依賴性方式增加STAT3的磷酸化和eNOS活性，發揮抗AS作用。

3.1.6 OxLDL/精氨酸酶/eNOS-解偶聯/NO通路與AS

高膽固醇血癥通過影響eNOS的功能和活性降低血管NO生物利用度。oxLDL刺激血管壁中的NADPH氧化酶，介導eNOS輔因子四氫生物蝶呤(BH4)的氧化，導致eNOS發生解偶聯。精氨酸酶(尿素循環中的一個關鍵酶)能直接與eNOS競爭共同底物L-精氨酸以及抑制eNOS的活性，影響NO的生成，導致內皮功能障礙。最近的研究都支持精氨酸酶(包括酶Ⅰ和酶Ⅱ)能引起eNOS解偶聯，精氨酸酶的表達與活性在AS中上調。PANDEY等[30]研究發現人主動脈內皮細胞中和鼠主動脈內膜中OxLDL觸發精氨酸酶2從線粒體轉移到細胞質，并伴隨精氨酸酶活性的上升，eNOS解偶聯，內皮功能障礙和動脈粥樣化形成。線粒體加工肽酶的抑制劑或凝集素樣OxLDL受體-1敲除減弱OxLDL 介導的內皮特異性NO產生的減少和超氧化物生成的增加[30]。

3.2 iNOS相關的一氧化氮信號通路與AS

3.2.1 NF-κB-iNOS-NO通路與AS

NF-κB代表轉錄因子家族，包括在調節炎癥反應中重要的p50和p65。NF-κBp50和p65轉移到核，參與不同細胞過程(包括炎癥，增殖，凋亡和細胞衰老)的多種基因的轉錄[31]。在人類AS病變中的巨噬細胞，平滑肌細胞和內皮細胞中已經發現活化的NF-κB，但是在健康的血管中沒有發現。NF-κB調節iNOS基因：iNOS催化NO的產生，NO是在炎癥和免疫應答中起作用的分子[32]。由病原體或細胞因子誘導的血管炎癥反應伴隨著過氧亞硝酸鹽的產生，過氧亞硝酸鹽是通過NO和超氧化物的反應形成的有效和血管毒性分子。P.g-LPS可能通激活NF-κB/iNOS/NO通路，誘導NO生成,導致內皮細胞氧化應激損傷,誘導其凋亡,直接破壞血管內皮,從而導致AS的發生發展[33]。NF-κB-iNOS-NO信號通路的激活加速AS的發展。

在大多數細胞類型中最常見的NF-κB形式是p65/p50異源二聚體，并且NF-κB信號受IκB激酶(IKK)復合體控制，IKK復合體由IKKa、IKKb、IKKc和下游底物IκBα(IκB的主要類型)組成。刺激后，活化的IKK磷酸化IkBa，導致IkBa降解，增強NF-κB核易位，以及隨后的轉錄激活。rAd-APN-eGFP和PDTC一樣可通過抑制核因子κB通路的激活來減輕動脈粥樣硬化這種炎癥反應[34]。

Ang Ⅱ[35]、H2O2[31]、TNF-α[32]活化NADH/NADPH氧化酶，誘導產生的ROS激活NF-kB信號通路。ROS已被假設為導致NF-kB活化的第二信使[35]。Ang Ⅱ誘導的人內皮細胞[35-36]、H2O2誘導的大鼠血管平滑肌細胞(RVSMC)[31]、TNF-α誘導的RVSMC[32]中ROS生成增加激活NF-kB信號通路。而使用藥物預處理上述模型通過保護IkB-α抑制劑的降解和下調NF-κB亞基(p50和p65)的表達，抑制NF-κB轉運進入細胞核，減弱iNOS生成NO，緩解AS的形成[31,35-36]。在糖尿病相關的AS中谷胱甘肽過氧化物酶-1(GPx1)是一個關鍵的抗氧化酶。GPx1基因敲除(GPx1 KO)小鼠分離的主動脈內皮細胞(PAECs)中IkBα降解延長，NF-κB通路的活化促進AS的發展。

在棕櫚酸(PA)誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)損傷模型中，Honokiol通過抑制IKK/IκB/NF-κB信號通路中的IκB磷酸化和NF-κB活化，降低iNOS的表達和NO的生成，從而減輕PA引發的炎癥反應以及修復內皮功能障礙[37]。

LPS與IFN-γ組合[38]和TNF-α誘導VSMC產生炎癥反應，上述血管炎癥促進AS等疾病的進展，其中涉及的通路除了IKK/IκBα/NF-κB/iNOS/NO通路，還包括IKK-IκBα-非依賴的-NF-κB-iNOS-NO通路。

PMC處理抑制VSMC中LPS與IFN-γ的作用，PMC顯著抑制p65的易位和磷酸化，蛋白磷酸酶2A(PP2A)失活和ROS的形成，降低iNOS表達，而對IκBα降解、IκB激酶(IKK)沒有影響[38]。PP2A選擇性抑制劑岡田酸和用PP2A siRNA轉染顯著逆轉PMC介導的iNOS表達、NF-κB啟動子活性和p65磷酸化的抑制。LPS/IFN-γ刺激的VSMC的細胞提取物的免疫沉淀分析顯示p65與PP2A共定位，PP2A誘導p65磷酸化。表明LPS/IFN-γ刺激通過激活ROS-PP2A-NF-κB p65-iNOS-NO通路促進AS[38]。

3.2.2 JAK2/STAT3-iNOS-NO與AS

在AS晚期，內皮和免疫細胞的STAT3激活可能加劇炎癥[34]。炎癥介質的過度或長期產生可導致AS。脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7巨噬細胞中iNOS、NO、環氧合酶-2(COX-2)等生成增加，藥物處理通過抑制核信號轉導和核易位轉錄(STAT)3活化，減少LPS介導的Janus的激酶(JAK)2和STAT3在Ser727和Tyr705位點的磷酸化，從而降低LPS介導的巨噬細胞炎癥反應[39]。

3.2.3 MAPK(ERK1/2，JNK1/2和p38)-iNOS-NO與AS

TNF-α誘導人主動脈平滑肌細胞的炎癥反應可以通過抑制p38 MAPK/ERK信號通路降低NO的產生而減輕[40]。

在LPS誘導的大鼠主動脈平滑肌(A7r5)細胞炎癥反應模型中，用非細胞毒性濃度的TS和GA預處理(抗AS作用)通過下調iNOS顯著抑制炎癥性NO產生，iNOS/NO的抑制與MAPK(ERK1/2，JNK1/2和p38)磷酸化降低相關。YU等[39]研究發現RES(抗炎作用)降低LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞中的NO，iNOS，同時抑制LPS誘導JNK/p38 MAPK信號通路的激活。綜上可知炎癥反應相關的MAPK信號通路促進AS的發展。

3.2.4 Nrf2/iNOS/NO與AS

有研究[35-36]表明，血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)處理的人內皮細胞(EA.hy926)和人主動脈平滑肌細胞(HASMC)中氧化應激增強。添加藥物后通過增強Nrf2信號促進超氧化物歧化酶(SOD)的產生和誘導HO-1的表達，上述變化可以降低Ang Ⅱ引起的ROS生成，從而抑制ROS-NF-κB-iNOS-NO通路，緩解Ang Ⅱ引發的血管內皮功能障礙。Ang Ⅱ在巨噬細胞中激活PI3K后還可以增加巨噬細胞活性并增強免疫炎癥反應,而這些過程均和AS的形成有關[41]。有效的Nrf2/抗氧化反應元件(ARE)激活抑制LPS誘導NF-kB核易位和DNA結合活性，并進一步阻止肝iNOS表達和NO生產。Nrf2敲除小鼠顯示顯著升高的iNOS表達。綜上可知，Nrf2降低iNOS表達和NO的過度產生緩解AS的發展。

4 NO作用的信號通路與AS

NO通過刺激可溶性鳥苷酸環化酶(sGC)生成環磷酸鳥苷(cGMP)調節血管平滑肌細胞的收縮程度。此外，NO還介導冠狀動脈在缺氧狀態下收縮程度的加強，該反應取決于sGC的含量但獨立于cGMP的生成。SEGURA等[42]研究顯示乙醇提取物Rumex acetosa L.(ERA)在分離的苯腎上腺素預收縮大鼠胸部主動脈的血管舒張作用被ODQ(sGC抑制劑)消除，從而得知NO介導的血管舒張由肌肉NO-sGC-cGMP信號通路進行調節。此外，ROS通過氧化NO受體sGC損傷NO的功能促進AS發展。GUCY1A3通過編碼sGC的α1亞型，促進平滑肌細胞表型從收縮狀態轉換成合成狀態，從而促進AS的形成。通過抑制sGC活性防止此種轉換可能為AS疾病提供一個新的治療目標[42]。

5 結語

eNOS、nNOS合成適量的NO發揮抗AS作用，而iNOS合成過多的NO促進AS發生和發展。在脂質浸潤、氧化應激、炎癥反應等病理條件下，eNOS、nNOS活性降低，iNOS活性增強，NO通過相關的信號通路促進AS形成。但目前NO信號通路與AS形成的作用機制尚未完全闡明，需要進一步的研究，有利于更好地認識和干預NO信號通路，為研究臨床治療AS的NO相關藥物提供幫助。