骨髓干細胞移植治療急性心肌梗死的研究進展

盧文燕，張 明

(1.南昌大學研究生院醫學部2018級；2.江西省人民醫院全科醫學科,南昌 330006)

急性心肌梗死(AMI)是在冠狀動脈粥樣硬化病變的基礎上，因冠脈管腔內血栓形成，造成急性冠脈閉塞，相應心肌細胞供血中斷，導致心肌細胞嚴重而持久的急性缺血性壞死。為了盡快使閉塞的血管再通，再灌注治療已成為目前治療AMI的重要緊急措施。再灌注治療方法包括溶栓治療和急診經皮冠狀動脈介入治療(PCI)，但由于急診PCI在基層醫院可能并未開展或者技術不成熟，導致患者轉入上級醫院時已經造成部分心肌細胞缺血壞死，而溶栓治療又有其適應證、禁忌證，部分患者不宜進行溶栓治療，同樣造成心肌梗死。其中更有部分急性期患者因未能及時疏通或重建血運而迅速造成大面積心肌梗死，心臟為維持其泵血功能，發生退行性左室重塑，甚至形成室壁瘤，最終導致心功能不斷惡化而心力衰竭。以往認為成熟的心肌細胞缺乏再生能力，心肌梗死發生后，梗死區心肌只能通過纖維增生，由無收縮功能的疤痕組織代替。因而即使恢復或重建血運通路，也不能從根本上修復壞死心肌組織。心肌梗死后在梗死灶周邊及正常的心肌組織中也有少量心肌細胞發生有絲分裂，以增殖修復受損的心肌組織。而TAKAHASHI等[1]的研究表明骨髓單個核細胞(MNCs)培養液能產生多種細胞因子，這些細胞因子通過直接保護心肌細胞，增強心肌的收縮能力，抑制心肌細胞的凋亡，誘導梗死灶周圍微血管生成，從而促進梗死心臟功能的改善。

干細胞是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有分化成各種細胞、組織、器官的潛在功能。根據來源不同，分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞面臨細胞標本短缺、免疫排斥、倫理道德等方面的問題，使之應用受限。骨髓干細胞(BMCs)屬于成體干細胞，目前認為其主要包含以下兩類干細胞：骨髓間充質干細胞(MSCs)和造血干細胞。由于骨髓干細胞通過溫和的機械分離即能制備單細胞懸液，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，來源廣泛，且可自體移植，受到廣大學者的青睞。骨髓干細胞能分化為心肌細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞及多種細胞因子等。因此，通過干細胞移植阻止心臟衰竭的惡化進程甚至去恢復心肌損傷患者的心功能，給心肌梗死的治療開辟了一個嶄新的前景。本文就干細胞移植治療急性心肌梗死的作用機制、研究狀況、存在的問題及前景進行綜述。

1 作用機制

1.1 干細胞分化成心肌細胞

早在1999年TOMITA等[2]研究表明，體外培養中，5-aza培養的BMCs可形成肌鈣蛋白Ⅰ和肌球蛋白重鏈染色陽性的肌小管；體內研究中，將BMCs移植到冷損傷性心臟痕組織中，8周后檢測也可見心肌樣肌細胞，肌球蛋白重鏈和肌鈣蛋白Ⅰ染色陽性，心臟功能較前顯著改善。SZARAZ等[3]利用qPCR技術分析體外培養基cTnT和MYH6基因表達水平，結果發現實驗組cTnT mRNA水平高于對照組，MYH6 mRNA的表達在干細胞分化過程中也被強烈誘導。并采用流式細胞術分析心源性分化標記物，結果顯示心肌細胞標記信號調節蛋白α和縫隙連接蛋白43(Cx43)的表達水平高于對照組，表明間充質干細胞能分化為功能性心肌細胞樣細胞。

1.2 干細胞旁分泌機制產生多種細胞因子

TAKAHASHI等[1]在研究中發現BMCs無論是在缺氧還是常氧條件下均能明顯抑制成齡大鼠心肌細胞的凋亡，同時增加梗死后心肌微血管的密度，縮小纖維瘢痕的面積，明顯提高心臟的功能。他們收集BMCs的培養液做ELISA和Western bloting分析，發現BMCs產生了多種細胞因子(包括VEGF、IL-6、PDGF、IGF-1)，其中一些在缺氧的條件下是明顯增加的。研究表明BMCs產生的細胞因子增強了心肌細胞對抗缺血損傷的能力，誘導了血管的新生，抑制了梗死心臟的重構，這對干細胞移植治療心肌梗死意義重大。TANG等[4]對心肌梗死小鼠進行自體MSCs移植，2個月后發現小鼠梗死區毛細血管密度增高，VEGF表達明顯升高，心肌細胞凋亡減少，心功能明顯改善。其可能機制為MSCs在損傷區域可以自身分泌和上調周邊細胞表達多種細胞活性因子；MSCs自我更新能力能維持長期的血管再生狀態。

1.3 干細胞減少炎癥因子

LUGER等[5]將小鼠左前降支阻斷45 min，在心肌梗死后24 h，實驗組靜脈注射2×106MSCs，對照組注射生理鹽水，每組各16只，21 d后，發現MSCs組明顯降低心臟和脾臟的自然殺傷細胞和心臟的中性粒細胞。研究發現心肌梗死前24 h特異性自然殺傷細胞耗竭可改善梗死面積、左心室射血分數、左室重構及減少心臟中性粒細胞。這表明MSCs通過全身抗炎作用改善急性心肌梗死的左心功能障礙。

1.4 干細胞外泌體發揮重要作用

干細胞分泌的胞外小泡有刺激血管生成，保護細胞，調節細胞凋亡的作用。DOUGHERTY等[6]從人類誘導的多能干細胞源性心肌細胞(hiPSC-CM)培養基中分離出分泌顆粒，并用射透電鏡、納米粒子追蹤分析、免疫印跡證實了分泌顆粒的大小和形態與外泌體一致。此外，在研究外泌體對牛主動脈內皮細胞(BAEC)的管壁形成、傷口愈合和細胞增殖的影響時發現，與對照組(NO-Exosomes)相比，100 μg·mL-1CM-ES處理的BAEC在管壁形成、傷口愈合和細胞增殖方面均有顯著提高。結果表明，從hiPSC-CM中分離出的Exosomes能促進血管內皮細胞生成和細胞增殖。該研究闡明了干細胞移植治療心肌梗死新的作用機制，為疾病的治療提供了新的理論基礎。

2 基礎與臨床研究現狀

2.1 基礎研究

LUO等[7]為了解決干細胞生長、保存和運輸的問題，將人骨髓間充質干細胞分泌因子包裝成聚乳酸-乙醇酸微粒子，然后包被MSC膜，形成非物理粒子合成MSC(或synMSC)，結果發現，synMSC顯示出與真MSC相似的因子釋放譜和表面抗原，并能發揮MSC的促進心肌細胞和血管再生的功能及顯示低溫環境下體外或體內保存和凍干穩定性。LUGER等[5]對鼠的研究發現注射生理鹽水對照組左室重構不良，左室射血分數惡化，而靜脈給予間充質干細胞實驗組消除了左室舒張末期容積和左室收縮末期容積的惡化，另外在缺血性心肌病模型中，心肌梗死后4周給予小鼠(n=16)尾靜脈注射2×106MSCs，第3周重復注射，與對照組(n=16)相比，骨髓間充質干細胞組左室射血分數明顯增加，左室收縮末期容積減少。MENG等[8]將白介素10(IL-10)基因通過轉錄激活物樣效應核酸酶(TALEN)整合到羊膜間充質干細胞(AMM)基因組中，并翻譯成IL-10基因編輯的羊膜間充質干細胞(AMM/I)，將AMM/I移植到AMI小鼠模型中，發現AMM/I移植可明顯抑制CD68陽性或F4/80陽性的浸潤性炎癥細胞，降低梗死心肌中促炎因子的表達。此外，還發現，采用AMM/I移植的小鼠心肌細胞周圍毛細血管密度明顯增加，梗死面積明顯縮小，左室功能得到改善，并且AMM/I對心肌細胞凋亡具有高度抑制作用。此項研究表明，AMM/I移植通過抑制細胞炎癥、增加毛細血管密度、抑制細胞凋亡等方面的作用，對左心室功能的早期恢復和重構發揮了良好的作用。然而移植的細胞在缺血缺氧環境下存活不良會降低其治療效果。Follistatin-like 1(Fstl1)是一種新型促生存的心肌因子，在缺血環境中對細胞具有保護作用。SHEN等[9]將骨髓間充質干細胞在缺氧條件下模擬心肌缺血環境，分別于缺氧后0、24、48 h檢測Fstl1的表達，在低氧處理48 h后，進一步收集間充質干細胞進行細胞死亡和增殖試驗，結果發現Fstl1在缺氧間充質干細胞中的表達呈明顯的時間依賴性下降，體外研究進一步證實Fstl1促進缺氧間充質干細胞的存活和增殖。因此可以推測，Fstl1可以顯著延長MSC植入人體后的存活時間。同時他們將MSCs(MSCs-mcherry)或Fstl1過表達MSCs(MSCs-fstl1)注入小鼠梗死周圍區，在治療后1、3、7 d對供體細胞的保留情況進行評估，并計算梗死面積、梗死心臟的新生血管及心肌功能。結果發現MSCs-fstl1組顯著延長供體細胞的存活時間，并且通過限制瘢痕形成、減少炎癥反應、增強新生血管，明顯改善心肌梗死后的心功能。這表明fstl1是一種促進骨髓間充質干細胞存活和增殖的內源性心臟因子，可以優化骨髓間充質干細胞移植的治療效果。

2.2 臨床研究

KIM等[10]進行的一項隨機對照臨床試驗，將26例急性ST段抬高型心肌梗死PCI術后患者分為骨髓間充質干細胞(BM-MSC)組(n=14)和對照組(n=12)，對照組在梗死后給予常規治療，BM-MSC組在PCI術后1個月冠狀動脈內注射自體骨髓間充質干細胞，并給予常規治療。觀察左室射血分數(LVEF)從基線到隨訪4個月后的變化。通過SPECT測定，BM-MSC組LVEF較對照組明顯增加。通過超聲心動圖測定，隨訪4個月時LVEF增加幅度細胞組顯著高于對照組[(9.0±4.7)%比(5.3±2.6)%，P=0.023]。在整個研究過程中，細胞移植并未增加不良臨床事件、支架內再狹窄或心律失常風險。LI等[11]進行了一項80例患者參與的隨機對照試驗，在成功完成再灌注治療后1個月，經冠狀動脈注入骨髓間充質干細胞至梗死相關動脈，隨訪6個月后發現，骨髓間充質干細胞組LVEF的改善幅度明顯大于對照組[(5.9±8.5)%比(1.6±7.0)%，P=0.037]，在治療過程中，未發現干細胞治療相關毒性，隨訪期間無明顯不良心血管事件發生?？梢?，冠狀動脈內灌注骨髓間充質干細胞是安全有效的。張艷平等[12]將8項隨機對照臨床試驗共410例納入薈萃分析，結果顯示在有效性方面，移植后3、6、12個月，移植組左室射血分數均較對照組明顯增加，差異有統計學意義；在安全性方面，移植組和對照組差異無統計學意義。肖文濤等[13]進行的一項自體MNCs、MSCs經梗死相關冠狀動脈(IRCA)內序貫移植治療AMI的臨床研究，分別于移植后3、6個月測定LVEF和心肌灌注缺損面積百分數，結果顯示移植組LVEF和心肌灌注缺損面積百分數均較對照組明顯改善，且2組惡性心血管事件發生率差異無統計學意義。

然而LAGUNA等[14]選用LVEF低于50%，有冠脈搭橋(CABG)適應證的20例透壁性心肌梗死患者進行隨機對照試驗，在急性心肌梗死后第10—15天，干細胞組在體外循環下采用心肌內直接注射骨髓單個核細胞(MNCs)，對照組僅行CABG治療。術前、術后9個月行釓磁共振成像及應激性超聲心動圖檢查。最后17例患者完成隨訪，分析研究結果，在2組基線特征基本一致的前提下，2組LVEF變化幅度、整體室壁運動減低水平或局部室壁運動減低水平、舒張末期容積下降幅度或收縮末期容積下降幅度比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。此項研究結果表明，AMI患者在冠脈搭橋時心肌內注射MNCs對心室重構及心臟功能無中—遠期改善作用。另外NICOLAU等[15]的隨機對照臨床試驗也得出相似結論，即冠狀動脈內灌注MNCs并沒有改善左心室重構或減少梗死面積。但從具體數值上分析，在LAGUNA等[14]的研究細胞組的指標除局部室壁運動減低水平外，其余指標均優于對照組，且該研究樣本量少，用于結果分析的僅17例，這可能影響試驗結果的說服力。所以需要開展更多大樣本、多中心、雙盲、隨機對照試驗來進一步證實。綜合分析以上研究，不難發現各方研究者利用的移植時間、移植途徑、細胞種類、細胞數量、患者初始左室射血分數不一，造成研究結果不盡相同。在今后通過控制這些可控因素，將干細胞聯合某種或多種細胞因子整合到生物材料中，以期尋找一種最優化組合，為臨床應用干細胞治療心肌梗死提供強有力的治療方案。

3 存在的問題

3.1 干細胞歸巢率、分化率差

骨髓間充質干細胞是心肌細胞修復和再生的種子細胞，但其歸巢率和分化率差，不能最大程度分化成心肌細胞，在臨床應用中受到了一定的限制。YANG等[16]研究發現超聲靶向微泡破壞介導的趨化因子 12(CXCL 12)和骨形態發生蛋白-2(BMP-2)共轉染能顯著促進干細胞移植后梗死心肌的修復和再生；LU等[17]的研究也表明間充質干細胞通過CXCL 12趨化途徑向梗死灶周邊招募常駐心臟內皮細胞，從而改善AMI小鼠模型的心臟功能，其中CXCL 12是歸巢因子，BMP 2是促分化因子，但是兩種因子以何種比例聯用才能達到更好的治療效果，還需要更多高質量的基礎研究及臨床研究來證實。

3.2 移植細胞存活率低

梗死區缺血缺氧和炎癥狀態會促使移植細胞死亡，從而降低干細胞對缺血性心臟病的治療效果。Bcl-2是細胞凋亡中最受關注的癌基因之一，它具有抑制凋亡的作用。LI等[11]使用Bcl-2基因對MSCs進行基因改造，組裝成Bcl-2過表達MSCs，將Bcl-2-MSCs或單純MSCs移植到心肌梗死大鼠中，與MSCs組相比，Bcl-2-MSCs組在移植后4 d、3周和6周時細胞存活率分別增加了2.2倍、1.9倍和1.2倍。KITABAYASHI等[18]對梗死大鼠的研究發現，Bcl-2修飾的骨骼肌成肌細胞組移植細胞存活時間延長，心肌纖維化減少，梗死區和邊緣區血管密度增加，心功能明顯改善。2項研究都支持Bcl-2能夠提高移植細胞抵御心肌梗死區惡劣環境的能力，但僅限于動物研究，在人體中是否有效還有待考證。

3.3 干細胞的增殖分化需要強化

單純的細胞移植后其轉分化率及表達結構功能的程度并未達到人們的預期理想，因此人們開始傾力于對細胞的增殖分化有促進作用的生長因子的研究。CHANG等[19]在左前降支閉塞的Sprague-Dawley大鼠心肌梗死模型中發現，移植后12周，脂肪源性成人干細胞聯合生長因子復合物(ADAS-GFS)移植組與ADAS移植組或對照組比較，ADAS-GFS移植組梗死區周圍毛細血管增多，左心室功能明顯改善，與ADAS移植組或對照組比較差異有統計學意義，這些數據表明生長因子能夠提高干細胞向血管內皮細胞分化的潛能。然而生長因子由于其易彌散而不能持久作用，以及如何與微環境中的移植細胞達到最有效的生物性結合又成為研究中懸而未解的問題。

3.4 干細胞治療的安全性問題

不少研究發現干細胞治療存在安全隱患。GLEESON等[20]在全枸櫞酸血中添加間充質干細胞后發現可增強動脈剪切時血小板在膠原蛋白上的血栓沉積，肝素聯合用藥可消除這一效應；在豬急性心肌梗死模型中，在再灌注期間注入25×106間充質干細胞后，冠狀動脈血流減少，聯用肝素可消除該效應，說明MSCs有形成血栓的前活性，這對于心肌梗死患者來說是非常不利的。SIMINIAK等[21]將10例患者的自體骨骼肌成肌細胞在體外培養3周后進行移植，術后早期2例出現持續性室性心動過速，其余2例隨訪2周后發生持續性室性心動過速。還有學者認為干細胞移植會導致腫瘤發生。GAO等[22]在臨床研究中發現1例患者在注射細胞的過程中發生嚴重的冠狀動脈阻塞并發癥；LALU等[23]進行的薈萃分析共收集了668項研究，其中23項符合資格標準，結果發現間充質干細胞與急性不良事件之間無相關性，表明MSCs治療缺血性心臟病似乎是安全的。為進一步明確骨髓間充質干細胞的收益—風險狀況，有必要進行精心設計、更大規模的隨機對照試驗。

此外，還有骨髓干細胞自噬問題、分化的細胞能否長期維持心肌細胞功能等問題。

4 小結與展望

盡管目前治療急性心肌梗死的手段多樣，但AMI的預后欠佳，病死率仍然居高不下，是心血管領域亟需攻克的一大難題，需要找到新的治療方法來改變心肌梗死的預后。因此，國內外學者試圖用干細胞移植來治療心肌梗死，目前已有大量臨床研究證實干細胞移植對于AMI的治療有一定的療效，但由于移植后分化率低、形成新的血栓、誘發心律失常、形成腫瘤，甚至有研究發現移植后并無改善心功能的作用等方面的問題，該治療方法尚未應用于臨床。但是，筆者仍相信干細胞在心肌梗死治療領域的積極作用，并且預計該領域的迅速進展和生物技術的進步將解決這些問題，期待干細胞移植為心肌梗死的治療開辟一條新“通路”。