黃芪甲苷調控p62-Nrf2通路對抗小鼠淋巴細胞白血病耐藥株的機制研究*

王曉玲，楊小娟，鄭倩倩，侯夢雪，王旭，汪濤

（天津中醫藥大學中西醫結合學院，天津 301617）

白血病是一類源于骨髓造血干/祖細胞異?？寺≡鲋承约膊?，其發病率與病死率均居于惡性腫瘤前列[1]?；熓桥R床首選方法，但常出現耐藥，這已成為臨床難以突破的瓶頸，且是白血病復發的主因，尋找具有減毒增效、逆轉耐藥作用的藥物有重要意義。當臨床使用順鉑（DDP）長期治療時，腫瘤細胞會激活核因子紅細胞樣2相關因子2（Nrf2）通路，促進其下游抗氧化基因如醌氧化還原酶1、血紅素氧化酶1（HO-1）及藥物轉運體蛋白的表達產生耐藥。腫瘤細胞耐藥過程十分復雜，常涉及多個通路，包括Nrf2 通路與自噬、核因子 κB（NF-κB）等，而多功能銜接蛋白p62可能是信號通路交互作用的樞紐[2]。

白血病致病因素較多，多因虛致病，因病致虛，邪盛正虛，虛實夾雜，邪毒入髓傷血?！胺稣钚?，固本培元”是抗腫瘤的基本治則。黃芪是抗腫瘤常用扶正配方藥味之一，黃芪甲苷（AST Ⅳ）是其主要藥效成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫調節等多種功效。AST Ⅳ是否可協同DDP聯合抗腫瘤，發揮減毒增效、逆轉耐藥等作用，尚不明確。本實驗旨在基于p62-Nrf2通路探討AST Ⅳ對抗白血病細胞耐藥的干預機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 小鼠淋巴細胞白血病順鉑耐藥細胞株（L1210/DDP）購自美軒生物技術有限公司；AST Ⅳ標準品購自甄準生物公司；DDP購自Sigma公司；胎牛血清、RPMI1640培養基購自Gbico公司；熒光探針 2’，7’-二氯二氫熒光素（DCFH-DA）、細胞計數試劑盒-8（CCK-8）購自碧云天生物技術有限公司；Nrf2通路抑制劑ML-385購自Med Chem Express公司；鹽酸維拉帕米（VER）購自美侖生物技術有限公司；總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光適時定量聚合酶鏈式反應（Real time PCR）試劑盒和引物購自寶生物工程有限公司；細胞周期及凋亡檢測試劑盒購自三箭生物技術有限公司；蛋白定量試劑盒、蛋白裂解液購自索萊寶科技有限公司；p62、Nrf2、HO-1、B 淋巴細胞瘤-2基因（bcl-2）及半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）一抗購自CST公司、bcl-2相關蛋白X（bax）一抗購自Abcam公司。

1.2 細胞培養及分組 在37℃5%二氧化碳（CO2）條件下，L1210/DDP細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養 1～2 d，繼而用含 4、6、8 μg/mL DDP的完全培養基先后培養細胞1～2 d，再脫藥培養1～2 d，進行后續實驗。

將細胞分成空白組（blank，L1210/DDP）、模型組（model，L1210/DDP+8 μg/mL DDP）、黃芪甲苷組（AST Ⅳ，model組+100 μg/mL AST Ⅳ）、鹽酸維拉帕米（VER，model組+70 μg/mL VER）、Nrf2 通路抑制劑（ML385，model組+2 μmol/L ML385）組及抑制劑與黃芪甲苷組（ML385+AST Ⅳ，ML385組+100 μg/mL AST Ⅳ）6組。

1.3 CCK-8法檢測細胞對DDP的敏感性 將L1210/DDP細胞以5×105個/mL種于96孔板，待生長至對數期，按blank、model、AST Ⅳ及VER實驗組進行藥物干預48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，搖勻培養3 h后，酶標儀檢測OD值，細胞增殖抑制率=（1-藥物組OD值/對照組OD值）×100%。

1.4 流式細胞儀檢測細胞的ROS水平 將L1210/DDP細胞以1×106個/mL種于6孔板，待生長至對數期，按blank、model、AST Ⅳ及VER實驗組進行藥物干預48 h，收集細胞后磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌 2 次，1 000 r/min，離心 5 min，離心半徑 10 cm，棄上清，用含 DCFH-DA 探針的培養基（1∶1 000）懸浮細胞，37℃孵育20 min，每隔3～5 min顛倒混勻一下，PBS洗滌3次后懸浮細胞，上機檢測。

1.5 流式細胞儀檢測細胞周期、凋亡率的變化 將L1210/DDP細胞以1×106個/mL種于6孔板，依實驗6個分組培養48 h后，PBS洗滌2次，1 000 r/min，離心5min，離心半徑10cm，棄上清液。取1×105個/mL細胞分別加入 500 μL Binding Buffer、5 μL 膜聯蛋白 Annexin V-FITC、5 μL 碘化丙錠（PI）混勻，室溫避光反應15 min后，上機檢測凋亡率變化，并設空白對照與單染組。其余細胞逐滴加入70%預冷乙醇固定，4℃過夜保存，100 μL RNaseA溶液重懸細胞，37℃水浴30 min后加入400 μL PI混勻，4℃避光孵育30 min后上機檢測細胞周期變化。

1.6 Real time PCR檢測實驗各組細胞p62-Nrf2通路節點基因的表達變化 從GenBank中查找到小鼠的 β-actin、p62、Nrf2、HO-1、bcl-2、bax 及 Caspase-3基因序列，用Primer5．0軟件設計引物。依試劑盒操作說明提取實驗6組細胞的總RNA，并將總RNA反轉錄為cDNA，以cDNA產物用作定量PCR擴增的模板，進行PCR擴增反應。數據采用2-ΔΔCT相對定量法分析。見表1。

表1 各檢測基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of each detected gene

1.7 蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測實驗各組細胞p62-Nrf2通路節點基因的蛋白表達變化 收集實驗6個組細胞后，用RIPA裂解液提取蛋白，BCA試劑盒檢測細胞蛋白濃度。每組分別取20 μg蛋白，12%SDS-PAGE分離，濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉室溫封閉，4℃過夜，緩沖液洗去未結合一抗，加入二抗室溫封閉2 h，滴加顯色液，凝膠成像系統曝光顯影，Image J軟件對顯影條帶進行定量分析。

1.8 統計學方法 采用SPSS 24．0統計軟件進行統計學處理，數據均以均數±標準差（±s）表示，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 耐藥細胞L1210/DDP對DDP敏感性的變化 與model組相比，AST Ⅳ、VER組L1210/DDP細胞增殖抑制率明顯上升，差異有統計學意義（P＜0．05），而AST Ⅳ組與VER組細胞增殖抑制率比較無統計學意義。見表2。

表2 耐藥細胞增殖抑制率及ROS的變化（±s）Tab.2 Changes of proliferation inhibition rate and ROS in drug-resistant cells（±s）

表2 耐藥細胞增殖抑制率及ROS的變化（±s）Tab.2 Changes of proliferation inhibition rate and ROS in drug-resistant cells（±s）

注：與 blank 組相比，*P＜0．05；與 model組相比，#P＜0．05；與 AST Ⅳ組相比，△P＜0．05。

組別 n A值 增殖抑制率（%） ROS（%）blank 組 6 1．302±0．046#△ 0 96．340±1．431 model組 6 1．187±0．060*△ 8．83 96．917±0．174 AST Ⅳ組 6 1．084±0．029*# 16．74 93．563±0．566 VER 組 6 1．076±0．031*# 17．36 95．513±0．110#

2.2 耐藥細胞L1210/DDP ROS水平的變化 與model組相比，AST Ⅳ、VER組ROS水平呈下降趨勢，以VER 組下降顯著，差異有統計學意義（P＜0．05）。見表2。

2.3 耐藥細胞L1210/DDP細胞周期的變化 與model組相比，除blank組，實驗各組G0/G1期細胞百分比呈減少趨勢，AST Ⅳ、VER組S期細胞百分比呈增加趨勢，出現S期阻滯，同時AST Ⅳ組G2/M期細胞百分比也呈增加趨勢，表現為G2/M期阻滯；與AST Ⅳ組相比，實驗各組G0/G1期細胞百分比有增加趨勢，S期細胞百分比則均有減少趨勢，但除VER組外，而G2/M期細胞百分比以ML385及AST Ⅳ+ML385 組明顯減少，具有統計學差異（P＜0．05）。見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡率的變化（±s）Fig.1 Changes of cell cycle and apoptosis rate were detected by flow cytometry（±s）

2.4 耐藥細胞L1210/DDP凋亡率的變化 與model組相比，AST Ⅳ、VER組凋亡率呈升高趨勢，ML385組細胞凋亡率明顯減少，差異有統計學意義（P＜0．05）。與AST Ⅳ組相比，ML385組凋亡率顯著下降，差異有統計學意義（P＜0．05），而 AST Ⅳ+ML385 組的細胞凋亡率較ML385組有所上升，見圖1。

2.5 耐藥細胞 L1210/DDP p62、Nrf2、HO-1、bcl-2、bax及Caspase-3等基因mRNA表達變化 與model組相比，實驗各組細胞p62 mRNA相對表達量均有下調趨勢，ML385 組作用效果顯著（P＜0．05）；HO-1 mRNA 表達均顯著減少（P＜0．05）；bcl-2/bax mRNA表達量除AST Ⅳ+ML385組外均顯著下調（P＜0．05）；AST Ⅳ組、VER 組 Caspase-3 mRNA 表達均上調，AST Ⅳ組更明顯（P＜0．05），而 ML385 組、AST Ⅳ+ML385組的Caspase-3 mRNA表達有下調趨勢。與AST Ⅳ組相比，AST Ⅳ+ML385組的HO-1 mRNA表達顯著減少（P＜0．05）；ML385 組、AST Ⅳ+ML385 組的Caspase-3 mRNA表達顯著下調，差異有統計學意義（P＜0．05），見表3。

表3 p62-Nrf2通路各關鍵基因mRNA表達情況（±s）Tab.3 The mRNA expression of the key genes in p62-Nrf2 pathway（±s）

表3 p62-Nrf2通路各關鍵基因mRNA表達情況（±s）Tab.3 The mRNA expression of the key genes in p62-Nrf2 pathway（±s）

注：與 model組比較，*P＜0．05；與 AST Ⅳ組比較，#P＜0．05。

組別 n p62 Nrf2 HO-1 bcl-2/bax Caspase3 model組 6 1．00±0．00 1．00±0．00 1．00±0．00 1．00±0．0# 1．00±0．0 AST Ⅳ組 6 0．70±0．14 1．10±0．06 0．63±0．14*0．36±0．29*1．81±0．53*VER 組 6 0．84±0．18 1．29±0．36 0．50±0．07*0．32±0．19*1．43±0．24 ML385 組 6 0．59±0．20*1．05±0．23 0．52±0．12*0．31±0．27*0．66±0．10#AST Ⅳ+ML385 組 6 0．76±0．24 0．98±0．26 0．40±0．13*#0．61±0．49 0．77±0．45#

2.6 耐藥細胞 L1210/DDP p62、Nrf2、HO-1、bcl-2、bax及Caspase-3等蛋白表達變化 與model組相比，其他各組p62蛋白表達量均有減少趨勢；Nrf2蛋白表達量均有上調趨勢，且VER、AST Ⅳ+ML385組顯著上調，差異具有統計學意義（P＜0．05）；HO-1、bcl-2/bax蛋白的表達均呈下調趨勢；除ML385組外，凋亡相關蛋白Caspase-3的表達均有上升趨勢。與AST Ⅳ組相比，Nrf2蛋白表達量VER組、AST Ⅳ+ML385 組均明顯上調，差異具有統計學意義（P＜0．05），見圖2。

圖2 p62-Nrf2通路各關鍵蛋白表達變化Fig.2 Changes of the key protein expression in p62-Nrf2 pathway

3 討論

白血病屬中醫“血癥”“虛勞”“癥瘕”等范疇。扶正祛邪是其基本治則，補氣養血、益氣養陰以扶正，清熱解毒、活血祛瘀、化痰散結以祛邪。黃芪因具有補氣升陽，益氣固表等功效，常被醫家用于治療白血病氣血兩虛證，黃芪在體內外均有抗腫瘤作用，這與其主要藥效成分AST Ⅳ密切相關，AST Ⅳ通過抑制腫瘤細胞侵襲遷移、增殖分化并誘導其凋亡，逆轉耐藥及增強機體免疫對抗腫瘤[3-4]，并因腫瘤細胞種類不同效果存在差異性。本實驗也驗證了AST Ⅳ通過干擾細胞周期，造成S、G2/M期阻滯，抑制L1210/DDP細胞增殖，還通過上調Caspase-3基因表達及下調bcl-2/bax的表達比促進其凋亡，逆轉了腫瘤細胞化療耐藥，療效可與經典的多藥耐藥逆轉劑鹽酸維拉帕米（verapamil）相媲美。

DDP屬金屬鉑類絡合物，具有親核親電子特性，易與核酸堿基中的鳥嘌呤、腺嘌呤等的殘基形成共價鍵，也可與細胞的多種結構如核糖體、剪接體、端粒酶中的RNA及蛋白質中蛋氨酸，組氨酸和半胱氨酸等親核殘基相互作用，常在線粒體、溶酶體、內質網、細胞核及胞漿中積累，誘發細胞應激反應[5]。DDP既能激活腫瘤細胞死亡通路，也可誘發癌細胞的適應性反應如自噬、未折疊蛋白質反應和其他利于生存的信號如NF-κB、Nrf2[2]。細胞的最終命運是信號網絡串話的結果，而p62作為信號樞紐，通過調控轉錄因子NF-κB、Nrf2等關鍵分子的泛素化過程，連接自噬和凋亡信號，參與細胞生死之間的微妙平衡，此調控的分子基礎與p62的多個功能結構域有關，如與非典型激酶結合并介導p62自異構化的PB1區、促進NF-κB通路激活的ZZ區、與腫瘤壞死因子受體相關因子6結合的TB區、與Keap1相互作用的KIR區、通過自噬或泛素-蛋白酶體系統募集泛素連接蛋白促其降解的UBA區及與LC3相互作用的LIR區。當DDP進入細胞與線粒體結合時，導致細胞色素C釋放、鈣依賴性線粒體腫脹和ROS產生，誘發氧化應激，降低細胞基因組的穩定性[6]。此時，腫瘤細胞內Nrf2與其錨定蛋白氧化應激感受器Keap1發生解聚，轉位入核與抗氧化反應元件ARE結合，啟動下游靶基因表達，如Ⅱ相解毒酶、抗氧化反應酶及ATP結合轉運蛋白等，來抵抗化療藥物損傷，參與化療耐藥過程[2]。研究發現，p62可介導Keap1經自噬途徑降解，通過非經典通路激活Nrf2，且p62表達也受Nrf2調控，并形成一個抗氧化反應的p62-Nrf2-p62正反饋循環[7]。

前期實驗發現，與親本株相比，耐藥細胞株L1210/DDP存在Nrf2通路異常激活，而本實驗發現與模型組相比，AST Ⅳ可協同DDP作用于耐藥株，下調p62-Nrf2通路的關鍵基因p62的表達，使Keap1蛋白降解減少，在一定程度上抑制了Nrf2非經典通路激活，降低了腫瘤細胞HO-1的表達，減弱了細胞抗氧化應激反應的能力，對DDP的敏感性增強。另外有研究顯示Keap1還可結合破壞NF-κB通路的正調節因子IKKB，抑制NF-κB的促瘤作用，且抗凋亡的bcl-2蛋白也為Keap1-泛素連接酶復合體的底物，Keap1可減少bcl-2-bax異二聚體形成，促進腫瘤細胞凋亡[6]。并且有研究報道，對SKOV3/DDP卵巢癌細胞進行p62 RNAi后，顯著抑制p65核易位，下調NF-κB調控的促存活信號，進而逆轉癌細胞的DDP耐藥性[8]，因NF-κB信號調控著至少400個參與增殖、凋亡和炎癥相關的編碼基因，包括凋亡相關bcl-2家族及Caspase家族的基因，這提示在逆轉L1210/DDP化療耐藥過程中也可能存在著AST Ⅳ抑制NF-κB通路的靶向作用，但仍需進一步探討。bcl-2蛋白通過抑制細胞色素C的釋放，阻止胞質內細胞色素C對Caspase的激活來抑制細胞凋亡[9]。本實驗顯示，AST Ⅳ可通過降低bcl-2/bax蛋白表達比增加耐藥癌細胞的凋亡率，與Nrf2通路抑制劑ML385聯用效果更佳。這些研究結果或可輔證AST Ⅳ減毒增效的機制。ML385通過直接與Nrf2蛋白相互作用，阻止Nrf2-MAFG復合體與啟動子ARE序列的結合、減少Nrf2轉錄活性，抑制其下游靶基因p62、HO-1的表達。但本實驗中p62-Nrf2通路個別的節點、靶基因在基因轉錄、蛋白翻譯水平的調控無統計學差異，如與AST Ⅳ組相比，AST Ⅳ+ML385組p62、HO-1蛋白表達呈上調趨勢，這可能與實驗樣本量較少有關造成分析誤差，或存在其他通路如NF-κB交互調控有關，尚待進一步研究。本研究說明就癌細胞耐藥p62調控機制、AST Ⅳ的具體減毒增效的機制而言，還有許多研究的空白亟需深入探討，相關的研究成果或可為對抗白血病化療耐藥的中藥藥物篩選及臨床應用提供啟示。