荷葉堿降尿酸的1H-NMR代謝組學研究*

高利興，王麗明，隋洪飛，韓立峰

（1．天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300250；2．天津中醫藥大學，組分中藥國家重點實驗室，天津 301617）

近年來，隨著社會經濟的發展，人們生活方式和飲食結構發生了很大改變，高尿酸血癥作為一種代謝性疾病，其發病率持續升高，嚴重危害患者身體健康。高尿酸血癥是一種嘌呤代謝異常引起的疾病，是導致痛風發病的主要誘導因素和直接病因，高尿酸血癥還可誘發中風、糖尿病、冠心病和腦血管病、冠狀動脈疾病、腎臟損傷等嚴重性疾病[1-3]。高尿酸血癥的特點是在正常嘌呤飲食狀態下，非同日兩次測空腹血尿酸水平男性為血清尿酸鹽大于70 mg/L，女性為大于60 mg/L[4]。高尿酸血癥的危害除了引發痛風外[5-6]，還可加重冠心病或高血壓病等病癥[7-8]。此外，長期高尿酸血癥可破壞胰腺β細胞功能而誘發糖尿病[9]。大量尿酸長期從腎小管通過，形成尿酸結晶、結石沉積于腎臟，還會引發痛風性腎病，腎功能損害，甚至尿毒癥[10-12]。

荷葉堿是荷葉中主要的阿樸啡型生物堿，為荷葉生物堿中主要活性成分[13-14]。近年來，荷葉堿的藥理作用日益顯著，有文獻報道在小鼠高尿酸血癥模型中，荷葉堿的抗高尿酸和抗炎作用是通過調節腎有機離子轉運體和炎癥信號通路發揮作用，但是荷葉堿對生命體整體代謝網絡的影響仍有待進一步研究[15]。

代謝組學是一種被廣泛應用于植物學、疾病診斷和毒理學等領域的系統研究方法[16-19]。代謝組學研究常用的樣本有尿液、血漿或血清、唾液、腦脊液等生物體液及細胞提取物、細胞培養液和組織等，針對這些樣本的代謝產物研究可以反映機體健康狀態或疾病狀態下的重要信息。目前，代謝組學技術分析方法有許多，應用最廣泛的是氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）、液相色譜-質譜聯用法（LC-MS）及核磁共振法（NMR）[20]。NMR作為代謝組學的一個重要研究手段，具有分析全面、樣品制備簡單、重現性好的特點，而且可以同時提供代謝物定性、定量兩方面的信息[21]。

本研究主要運用核磁共振氫譜（1H-NMR）技術，將荷葉堿對氧嗪酸鉀誘導的高尿酸小鼠的血漿和尿液進行非靶向代謝組學研究，較為系統地分析氧嗪酸鉀誘導的高尿酸血癥模型小鼠及荷葉堿治療后的代謝物水平變化，通過多元統計分析找出變化顯著的代謝物，揭示氧嗪酸鉀誘導的高尿酸血癥模型動物的潛在生物標志物，同時為探討荷葉堿治療高尿酸血癥的作用機制提供參考。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器 Bruker ASCEND 500 MHz超導傅里葉變換核磁共振譜儀（瑞士Bruker公司）；3K15型高速離心機（美國Sigma公司）；XW-80A型渦旋混合器（上海滬西分析儀器廠）；HSS型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；電熱真空干燥箱（天津市天宇實驗儀器有限公司）；KQ-250E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 實驗試劑 重水（D2O，99．9%D）用于鎖場（劍橋同位素實驗室，美國）；2，2，3，3，-d4-3（三甲基硅基）丙酸鈉鹽（TSP），阿法埃莎化學有限公司]用于化學位移定標及定量分析；超純水（優級，屈臣氏公司）；磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O，天津市光復科技發展有限公司）；磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O，天津市風船化學試劑科技有限公司）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，天津市光復科技發展有限公司，用于溶解灌胃樣品）。

1.3 實驗藥材 荷葉堿標準品購自成都瑞芬思生物科技有限公司，純度大于98%；氧嗪酸鉀購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司，純度大于98%。

1.4 實驗動物 昆明雄性小鼠24只，體質量為（20±2）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。小鼠在實驗動物室進行為期1周的環境適應飼養，它們允許自由飲食及飲水，實驗動物房條件為：溫度：22～24℃，濕度：50%～65%的濕度，12 h光/暗周期。給藥前12 h禁食不禁水。所有動物實驗程序嚴格按照中國實驗動物學會標準進行，并經天津中醫藥大學醫學倫理委員會批準（小鼠合格證號：11400700389190）。

將荷葉堿和氧嗪酸鉀分別溶解在0．5%的羧甲基纖維素鈉混懸液中，根據前期研究，荷葉堿與氧嗪酸鉀的給藥劑量分別為25 mg/kg和200 mg/kg。

將小鼠按照每組8只隨機分為空白組、模型組和荷葉堿組。在本實驗中，空白組給予0．5%的羧甲基纖維素鈉灌胃；荷葉堿組先給予氧酸鉀灌胃，1 h后給予荷葉堿灌胃；模型組給予氧嗪酸鉀灌胃；均連續灌胃14 d。對于尿液樣品按照上述方法給藥后第13天將3組小鼠分別放入代謝籠過夜24 h，收集尿液，14 000 r/min，離心10 min，離心半徑10 cm，取上清液分裝存放-80℃冰箱，冷凍待用；血漿樣品在收集完尿樣后按照上述方法給藥后分別于2 h后眼眶靜脈叢取血，7 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，取上清液，置于-80℃待測。

2 實驗方法

2.1 核磁實驗方法

2.1.1 緩沖溶液的配制 0．045mol/LK2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液的配制：按照K2HPO4∶NaH2PO4的質量比為4∶1，加 10%D2O 和 0．6 mmol/L TSP 溶液溶解，用 pH計調節pH=7．4用于血漿樣品檢測。

2.1.2 1．5 mol/L K2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液的配制K2HPO4∶NaH2PO4=4∶1，加入 10%的 D2O 及 0．01%的TSP溶解，用pH計調節pH=7．4，用于尿樣檢測。

2.1.3 待測樣品的配制 將尿液放在室溫下自然解凍，14 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，取上清液，550 μL 尿液加入 55 μL 1．5 mol/L K2HPO4-NaH2PO4的緩沖溶液，渦旋5 min，14 000 r/min離心5 min，離心半徑10 cm，取上清液550 μL至5 mm核磁管中分析。將血漿樣品放在室溫下自然解凍，渦旋 5 min，取 200 μL 血漿加入 400 μL 的 0．045 mol/L K2HPO4-NaH2PO4的緩沖溶液，渦旋 5min，14000r/min離心5min，取上清液550μL至5mm核磁管中分析。

2.1.4 NMR實驗參數 Bruker ASCEND 500 MHz采集1H-NMR譜，反相檢測探頭（BBI），采集溫度為298 K，noesypr1d脈沖序列。此序列采用預飽和方式壓制溶劑峰，從而抑制溶劑信號的檢測。循環時間（D1），混合時間（D8）以及 90°脈沖時間（P1）分別為 2s，0．2 s，12．91 μs，中心激發頻率（O1P）為 4．69 ppm，預飽和水峰壓制功率（PLW9）為23 dB。采樣點數為32k，譜寬（SW）為10，330Hz，掃描次數（NS）為160次。

2D NMR譜圖均采用標準脈沖序列，其中包括COSY（1H-1H相關），HSQC，（1H-13C直接相關）HMBC（1H-13C遠程相關），TOCSY（1H-1H 全相關），J-RES（J-分辨光譜）。COSY脈沖序列為cosygpmfqf，梯度恢復時間（D16）為 0．2 μs，F1（1H）和 F2（1H）譜寬均為4 464．286 Hz，采樣點數陣為 t2×t1=2048×128，NS 為128次，2k數據點。HSQC的脈沖序列為hsqcetgpsi，其F1（13C）和 F2（1H）SW為 20831．980Hz和 4464．286Hz，弛豫時間為 1．457 811 s，采集時間為 0．118 834 s，采集數據點陣 t2×t1=1 024×256，NS 為 80 次，1 k 數據點。HMBC 的脈沖序列為 hmbcgpndqf，其 F1（13C）和F2（1H）SW 為 27 932．973 Hz 和 4 464．286 Hz，弛豫時間為 1．332 064 03 s，采集時間為 0．475 186 s，預掃描延遲時間為 6．50 μs，采集數據點陣 t2×t1=4 096×256，NS為160次，4k數據點。TOCSY脈沖序列為mlevphpp，其 F1（13C）和 F2（1H）SW 均為 4464．286Hz，弛豫時間為 1．898 965 s，采集時間為 0．237 618 s，D8為 0．08s，采集數據點陣 t2×t1=2048×256，NS為 100 次。J-RES的脈沖序列為jresqf，弛豫時間為2 s，采集時間為 0．102 450 s，F1 和 F2 維 SW 分別為 20．000 Hz和10 000．000 Hz，采樣數據點陣為 t2×t1=2 048×256，NS為32次，2 k數據點。

2.1.5 方法學考察 本實驗主要以樣品某一特征峰對應的化學位移以及相對峰面積考察樣品的穩定性及儀器的精密度。

穩定性實驗：任意選取一個樣品放置2、4、8、10、12、18、24及36 h后檢測特征峰的化學位移和相對峰面積，分別計算RSD（相對標準偏差）值。

精密度實驗：同一個樣品連續采集6次1HNMR譜圖，計算特征峰的化學位移和相對峰面積RSD值。

2.1.6 數據處理與分析1D NMR及2D NMR圖譜預處理使用Topspin（V3．5）軟件，包括指數窗函數變換、相位校正及基線矯正、化學位移漂移矯正（使用TSP）。多元統計分析用1H-NMR數據處理采用MestReNova 9．0．1 軟件，線寬因子設為 0．3 Hz，自由感應衰變為零填充到64 k數據點。除去TSP δ 0．00～0．02 ppm，水峰 δ 4．65～4．85 ppm。核磁共振光譜區以0．003 ppm 積分段對化學位移區間 δ 0．45～12．50 ppm進行分段積分。積分所得數據進行歸一化，并轉換為二維矩陣，保存為 CSV 格式，使用 SIMCA-P+（v14．0）軟件進行多變量分析，主要通過PCA（主成分分析）和OPLS-DA（正交偏最小二乘法判別分析）模型進行分析。PCA模型主要看樣本間分組趨勢以及樣本組內的離散程度；OPLS-DA模型主要得到得分散點圖和pearson圖。在得分散點圖中，每一個點代表不同的樣本，以樣本類別為變量（Y）建立一個PLS（最小二乘）模型，并獲得幾個與Y不相關的自變量（X）信息并將其替換，從而提高了模型識別能力。其中主要包括R2X，Q2兩個質量評價指標，越接近于1，代表預測的結果真實，模型可靠。在pearson圖中，核磁共振光譜區顏色越紅代表化合物差異越顯著，從而揭示了不同實驗方法中的代謝物的顯著變化。將OPLS-DA模型所給出的每一個變量的VIP值中大于1的變量作為對模型分組貢獻最大，并將此數據導出，結合 t檢驗，篩選 VIP＞1 且 P＜0．05 的變量進行分析。

將上述所得到的潛在差異代謝物的信息，通過2D NMR譜圖，數據庫（Human Metabolome Database，https：//hmdb．ca/）檢索，以及 Chenomx NMR Suite 軟件數據庫（Chenomx Inc．）等方法進行結構鑒定。

3 實驗結果

3.1 血漿尿酸檢測結果 將收集的血漿樣品室溫下自然解凍，渦旋5 min，混旋均勻，血漿中的尿酸水平用尿酸試劑盒進行檢測，所有血漿樣本均放于96孔板進行檢測，血漿尿酸的處理方法按照試劑盒使用說明書所描述的方法在自動生化分析儀（TECAN，瑞士）中測量，2h后結果空白組是（132．70±4．30）μmol/L、模型組是（188．14±4．81）μmol/L、荷葉堿組是（130．46±4．70）μmol/L，模型組與空白組相比（P＜0．01），荷葉堿組與模型組相比（P＜0．01），差異均具有統計學意義。

3.2 核磁實驗結果

3.2.1 方法學考察 樣品穩定性實驗特征峰的化學位移RSD值及相對峰面積RSD值如表1所示，結果表明樣品36 h內穩定。精密度實驗血樣和尿樣的特征峰的化學位移RSD值和相對峰面積RSD值均小于5%，說明儀器測量精密度良好。

表1 基于1H-NMR樣品中特征峰的精密度及穩定性Tab.1 The precision and stability of characteristic peaks in1H-NMR samples %

3.2.2 基于1H-NMR荷葉堿血漿和尿液樣品的指紋圖譜 荷葉堿作用于氧嗪酸鉀誘導的高尿酸血癥小鼠的血漿和尿液的核磁共振圖譜如圖1和2所示。其中 δ 0．05～4．00 ppm 為氨基酸及有機酸區，δ 4．00～5．50 ppm 為碳水化合物區，δ 5．50～8．70 ppm為芳香區。代謝產物的鑒定主要是基于文獻，在線數據庫（HMDB）以及Chenomx軟件，并結合2D NMR圖譜進行分析，共篩選出50個化合物。

圖1 空白組、模型組和荷葉堿組小鼠尿液樣品的1H-NMR譜圖Fig.1 1H-NMR spectra of mice urine samples in blank control group，model group and nuciferine treatment group

圖2 空白組、模型組和荷葉堿組小鼠血漿樣品的1H-NMR譜圖Fig.2 1H-NMR spectra of mice plasma samples in blank control group，model group and nuciferine treatment group

3.2.3 主成分分析 將荷葉堿作用于氧嗪酸鉀誘導的高尿酸血癥小鼠的血漿和尿液在1H-NMR采集的數據進行PCA分析，1H-NMR數據采樣模式下PCA的R2X和Q2值見表2。

表2 基于1H-NMR尿樣和血漿樣品的PCA參數值Tab.2 PCA parameter values based on1H-NMR urine and plasma samples

將血漿樣品和尿樣采集的數據進行PCA分析，制作PCA分析的得分圖，如圖3所示。在無監督模式的PCA分析下分組不太明顯，無法明顯區分不同組間的差異。然后利用有監督模式的正交偏最小二乘-判別分析進行分組比較分析。

圖3 基于1H-NMR譜的尿液（A）和血漿（B）PCA分析得分圖Fig.3 PCA scores plot of urine(A)and plasma(B)based on1H-NMR spectra

3.2.4 正交偏最小二乘法-判別分析 為進一步尋找給藥前后荷葉堿作用于氧嗪酸鉀誘導的高尿酸血癥小鼠的血漿和尿液的影響，本實驗采用OPLS-DA統計分析模型，用來尋找差異性化學成分，并利用得分圖和載荷圖表示，1H-NMR數據采樣模式下OPLS-DA的不同分組和樣品的模型結果參數見表3，尿液和血漿樣品的得分圖及載荷圖見圖4。

表3 基于1H-NMR尿樣和血漿的OPLS-DA參數值Tab.3 OPLS-DA parameter values based on1H-NMR urine and plasma samples

3.2.5 基于1H-NMR的差異化合物結果 通過統計學數據分析，選擇VIP＞1的化合物作為篩選荷葉堿作用于氧嗪酸鉀誘導的高尿酸血癥小鼠的血漿和尿液含量差異較大的化學成分，并根據候選差異化學成分在1H-NMR數據中的相對峰面積進行t檢驗分析，P＜0．05的數據可認為是潛在生物標志物，在血漿和尿液樣品中共找到9個潛在生物標志物，9個生物標志物的變化趨勢如表4所示。

圖4 基于1H-NMR譜的尿液（A）和血漿（B）OPLS-DA得分圖和載荷圖Fig.4 OPLS-DA score plots and loading plots based on1HNMR spectrum of urine(A)and plasma(B)

表4 基于1H-NMR的潛在生物標志物Tab.4 Potential biomarkers from1H-NMR spectra

3.3 差異代謝物的通路分析 通過1H-NMR技術在血漿和尿液樣品中共篩選出9個潛在生物標志物，為了進一步揭示這些差異代謝物之間的相關性，應用 metaboanalyst網站（https：//www．metaboanalyst．ca/）進行代謝通路富集分析，其中這9個潛在生物標志物均可以被數據庫（KEGG，https：//www．kegg．jp/）識別，涉及到多條代謝通路，結果如圖5所示，這些差異物主要涉及到酪氨酸代謝、檸檬酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝以及糖酵解和糖異生。

圖5 高尿酸血癥相關代謝通路圖Fig.5 Metabolic map of hyperuricemia-related pathways

4 討論

實驗采用了核磁共振氫譜技術對正常對照小鼠、氧嗪酸鉀誘導高尿酸血癥模型小鼠，及荷葉堿給藥治療組小鼠的血漿、尿樣進行了分析，實驗分別考察了zgpr、cpmgpr1d及noesypr1d等脈沖序列，以及NS分別為64、160、200時的信號采集情況，同時考察了壓水峰的功率PLW9分別為20、23、30、35 dB時的信號采集情況，結果表明，noesypr1d采集譜圖信號較好，而且隨著掃描次數的增加，血漿樣品中特征峰的峰強度相應增強，但采樣時間也相應增加，根據信號強度的變化并考慮實驗時間等因素，最終選擇采樣次數為160次，通過調節預飽和壓水峰的功率可以看出，當功率為23 dB時水峰的強度相對較小，對其他峰的影響也較小，樣品的特征峰具有較強的峰強度和分辨率。

代謝物鑒定一般采用同核化學位移相關譜（COSY），異核單量子相關譜（HSQC），異核多鍵相關譜（HMBC），全相關譜（TOCSY）等常規二維譜，JRES為一種通過J調制的自旋回波將化學位移與J耦合分開，從而使一維氫譜上重疊在一起的譜峰分散在平面上，是對擁擠譜峰指認的有效方法。本實驗綜合了各種二維譜及J-RES譜，實現了復雜譜峰的解析，為后續代謝通路分析提供數據支持。

本實驗闡明高尿酸血癥涉及的9個潛在生物標志物，它們涉及酪氨酸代謝、檸檬酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝以及糖酵解和糖異生等多個途徑。

精氨酸和脯氨酸代謝途徑：肌酐是肌酸的中間代謝產物，是骨骼肌的能量儲備，通常在腎功能受損時觀察到[22]。甜菜堿廣泛分布于動物，植物和微生物中，也是動物膽堿氧化的代謝產物，甜菜堿是肌酐下游的代謝產物[23]。在模型組中，肌酐、肌酸、甜菜堿的含量升高，說明腎功能遭到破壞；而荷葉堿治療組又恢復到正常水平，表明高尿酸血癥干擾了精氨酸和脯氨酸代謝途徑，荷葉堿具有較好的治療效果。

酪氨酸代謝途徑：酪氨酸是生酮生糖氨基酸，苯丙氨酸4-單加氧酶（PAH基因編碼蛋白）是關鍵酶，PAH蛋白功能可以催化苯丙氨酸轉化為酪氨酸，同時，苯丙氨酸在芳香族L-氨基酸脫羧酶的作用下轉化為苯乙胺，模型組中酪氨酸含量降低，而荷葉堿組的含量升高至正常水平，說明高尿酸血癥使酪氨酸代謝發生紊亂。

檸檬酸代謝途徑：檸檬酸是三羧酸循環的代謝產物，主要存在于線粒體中，是能量代謝的中心。檸檬酸裂解酶是檸檬酸轉化為醋酸鹽的關鍵酶，檸檬酸含量降低，醋酸鹽含量升高可能是檸檬酸酶被激活，使檸檬酸加速轉化為醋酸鹽。琥珀酸鹽是三羧酸（TCA）循環的重要中間體，位于代謝途徑的十字路口。在線粒體中，它在產生三磷酸腺苷中起關鍵作用，在模型組中琥珀酸的含量降低，而荷葉堿組又恢復到正常水平，提示高尿酸血癥使能量代謝發生異常，而荷葉堿能夠糾正這種異常。

糖酵解和糖異生途徑：丙酮酸是糖代謝中具有關鍵作用的中間產物。它可以通過乙酰輔酶A和三羧酸循環實現體內糖、脂肪和氨基酸間的互相轉化，為機體提供能量。與BC相比，丙酮酸的含量在模型組中增加，表明體內的能量代謝發生紊亂。

由于實驗采用核磁共振氫譜法進行檢測，該方法雖然通用，但也存在一定的不足，比如高尿酸血癥典型特征為尿酸的升高，而尿酸的化學結構為7，9-二氫-2，6，8（3H）三酮-1H-嘌呤，該化合物含有4個氫，均為活潑氫，在核磁共振譜上未出現信號，最終導致該化合物未被檢出，這提示1H-NMR代謝組學應與其他代謝組學技術（如LC-MS、GC-MS代謝組）相結合，取長補短，最終更加全面的反應生命體代謝特征。

5 結論

荷葉具有升發清陽，涼血止血的功效，臨床上主要用于治療用于暑熱煩渴，暑濕泄瀉，脾虛泄瀉，血熱吐衄，便血崩漏等癥。最近研究表明其主要成分荷葉堿具有顯著降尿酸效果，但關于其藥效的核磁代謝組學研究卻鮮有報道。本研究首先建立基于核磁共振氫譜技術的代謝組學研究方法，分別優化了脈沖序列，采樣掃描次數，預飽和壓水峰脈沖功率等參數，最終確定最佳數據采集方法。在此基礎上，本研究對小鼠的血漿和尿液進行代謝組學研究，較為系統地分析了氧嗪酸鉀誘導的高尿酸血癥模型小鼠的代謝特征，同時比較了經荷葉堿治療后的代謝物變化差異，綜合運用主成分分析及偏最小二乘法判別分析等多元統計分析方法，挖掘模型組與正常組及給藥組與模型組之間變化顯著的差異代謝物。在化合物的鑒定方面，本研究主要采用COSY、HSQC、HMBC、TOCSY等多種核磁二維譜技術，以及J-分辨譜，最終成功鑒定了50個化合物。多元統計結果顯示：從各組別中共篩選出與高尿酸血癥代謝通路密切相關的9個潛在生物標志物，分別為：丙酮酸、乙酸、酪氨酸、肌酸酐、乙酰乙酸、肌酸、檸檬酸、琥珀酸，以及甜菜堿。對這些代謝物進行進一步的通路富集分析說明了高尿酸血癥的病理過程主要涉及到酪氨酸代謝、檸檬酸代謝、精氨酸與脯氨酸代謝以及糖酵解和糖異生代謝途徑，預示著這些潛在生物標志物不僅在早期疾病診斷中起重要作用，而且在預防高尿酸血癥中也有重大意義。